Effekte von IGFBP2 auf Proliferation, Migration und Zellviabilität im hepatozellulären Karzinom

Hintergrund:

Mit einer weltweiten Prävalenz von 14 Millionen Erkrankten ist das hepatozelluläre Karzinom (HCC) die häufigste primär maligne Neoplasie der Leber (85 – 90%). Sie besitzt die dritthäufigste tumorbedingte Mortalität und ist oft mit einer schlechten Prognose bei Diagnosestellung verbunden. Das Insulin like growth factor (IGF) System ist durch die Bindung von IGF an den IGF Rezeptor an der Regulation von Wachstum, Zellteilung und Zellüberleben beteiligt. Insulin like growth factor binding proteins (IGFBPs) kontrollieren die IGF-Verfügbarkeit durch kompetitive Bindung von IGF und wirken somit limitierend auf proliferative IGF-Effekte. In Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe wurde das Gen für Insulin like growth factor binding protein 2 (IGFBP2) als Zielgen der p53 Familie, insbesondere von p73, mit prognostischer Relevanz im HCC identifiziert. Diese Familie von Tumorsuppressoren reagiert auf zellulären Stress unter anderem mit der Induktion von Seneszenz und Apoptose.

Infolgedessen wurde die p73-abhängige Induktion von IGFBP2 durch Gabe von HCC-Therapeutika getestet und die Wirkung von IGFBP2 auf Zellviabilität, Proliferation und Migration im HCC untersucht.

Methoden:

Die IGF Sekretion und Expression der IGF Oberflächenrezeptoren wurden in der humanen HCC Zelllinie Hep3B analysiert. Zellen wurden mit rekombinantem IGFBP2 (100 – 1000 ng/ml) kultiviert und anschließend die Proliferation mittels Durchflusszytometrie, die Zellviabilität mittels MTS Assay und die Zellmigration mittels Wound Healing Assay gemessen. Die Aktivierung des IGF Signalwegs wurde außerdem durch einen Milliplex Assay bestimmt. Zudem wurde die Wirkung der HCC-relevanten Therapeutika Doxorubicin, Bleomycin und Regorafenib auf p73 und IGFBP2 durch Western Blot, qPCR und ELISA analysiert.

Ergebnisse:

Hep3B Zellen wiesen ein intaktes IGF System mit konstanter IGF Sekretion über 96h und der Anwesenheit von IGF Rezeptoren auf der Oberfläche auf. Allgemein verbesserte sich die Zellviabilität zeitabhängig nach Zugabe von 100 – 500 ng/ml IGFBP2 um bis zu 115% nach 96h. IGFBP2-Konzentrationen zwischen 100 ng/ml und 250 ng/ml bewirkten nach 48h eine signifikante Steigerung der Proliferation um 16% und 18%. Übereinstimmend mit diesen Ergebnissen zeigten IGFBP2 Konzentrationen zwischen 100 und 500 ng/ml bereits nach 16h eine erhöhte Zellmigration. Die Analyse des IGF-Signalwegs zeigte für IGFBP2 Konzentrationen zwischen 100 ng/ml und 1000 ng/ml jedoch keine Veränderung im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Im Gegensatz zu obigen Ergebnissen resultierte die Behandlung von Hep3B Zellen mit den Therapeutika Bleomycin, Doxorubicin und Regorafenib in einer Induktion von sowohl TP73 als auch IGFBP2.

Fazit:

Obwohl IGFBP2 als wachstumslimitierend innerhalb des IGF-Systems gilt, wirkte es in rekombinanter Form wachstumsstimulierend auf HCC Zellen. Da keine Aktivierung des IGF-Signalwegs beobachtet wurde, muss jedoch der genaue Wirkmechanismus weiter analysiert werden. Dagegen wurde IGFBP2 gemeinsam mit TP73 durch HCC Therapeutika induziert. Dies stützt unsere Hypothese, dass p53-Familien-vermittelte Mechanismen IGFBP2-abhängige wachstumsstimulierende Signalwege in Richtung Wachstumsinhibition umleiten können. Eine detaillierte Aufklärung der Signaltransduktion entlang der p73-IGFBP2-Achse ist daher essentiell um neue diagnostische und therapeutische Optionen für das HCC zu entwickeln.