Ein initialer WNT-Puls verbessert Zellüberleben und Gewebeausbeute während der iPS-Chondrogenese

Fragestellung Artikuläre Chondrozyten werden für die klinische Knorpelregeneration verwendet, obwohl für ihre Entnahme gesundes Knorpelgewebe verletzt wird. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) sind eine attraktive Alternative, da sie unlimitiert, nichtinvasiv verfügbar sind und seit kurzem über mesenchymale Progenitoren zu stabilen Chondrozyten differenziert werden können. Jedoch ist der Zellverlust bisher erheblich, was auf unzureichende Anpassung an die Kulturbedingungen hindeutet. Während der Embryonalentwicklung initiiert ein WNT/β-Catenin-Puls die Mesenchymentwicklung. Unser Ziel ist zu prüfen, ob ein anfänglicher WNT/β-Catenin-Puls die Differenzierung, das Zellüberleben und die Gewebeausbeute während der iPS-Chondrogenese verbessert.

Methodik Die Standard-Differenzierung der zwei humanen iPS-Zelllinien (IMR, CB) bestand aus 14 Tagen Mesenchyminduktion mit FGF/Serum auf Matrigel/Gelatine, gefolgt von 3D-Pelletkultur mit 10ng/ml TGF-β1 für 6 Wochen. Mit 5µM CHIR99021 wurde für 24h zu Beginn der Mesenchyminduktion ein WNT/β-Catenin-Puls generiert. β-Catenin-Spiegel wurden mittels Western Blot, Zellüberleben/Proliferation mittels DNA- und Zellzahl-Quantifizierung und Differenzierung mittels PCR, cDNA-Microarray und Histologie untersucht.

Ergebnisse und Schlussfolgerung Signifikant erhöhte β-Catenin-Spiegel an Tag 1 bestätigten die erfolgreiche CHIR-Behandlung der Zellen. Verstärkte Senkung von Pluripotenzmarkern und Induktion von Mesodermmarkern zeigten bessere Mesenchymentwicklung an Tag 14 an. Bis zu 15-fach erhöhte DNA und Zellzahlen (Mittel 6,47±4,47) im Vergleich zur Kontrolle demonstrierten einen stark pro-proliferativen CHIR-Effekt (Abb. A). Sogar während der Chondrogenese wurde in der CHIR-Gruppe signifikant weniger Zellverlust beobachtet, resultierend in deutlich größeren Pellets mit gemittelt 42-fach höheren DNA-Werten an Tag 42 im Vergleich zur Kontrolle (Abb. B). Der relative Anteil der Kollagen-II und Proteoglykan-ablagernden Zellen blieb vergleichbar. War die Chondrogenese unzulänglich, wurde sie durch anfängliche WNT-Aktivierung nicht verbessert. Viele EZM-Gene, darunter COL6A1, DCN und LUM, wurden durch den WNT/β-Catenin-Puls signifikant erhöht.

Somit verbesserte ein kurzer initialer WNT-Puls Proliferation, Zellüberleben, Mesoderminduktion und Synthese von EZM-Komponenten, deren Mangel wir kürzlich mit Zellsterben während der iPS-Chondrogenese korrelieren konnten. Dadurch wurde eine signifikant höhere Knorpelgewebeausbeute erreicht für die Anwendung von Knorpelersatzgewebe für Krankheitsmodelle, pharmakologische Screens und die Knorpelregeneration.

Stichwörter Induzierte pluripotente Stammzellen; WNT; Knorpel

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Article published online:
15 October 2020