Neues Exon-Spezifisches ISoform-Expressions Reporter System (EXSISERS) zur Hochdurchsatz-Quantifizierung von p53 Protein Isoformen in Echtzeit und in lebenden Zellen

Einleitung In den meisten malignen Tumoren ist der Tumorsuppressor p53 mutiert, was oft zum Verlust der Funktionalität führt. Deshalb galt p53 lange Zeit nicht als therapeutisches Target. Doch die spezifische Expression von p53 Protein Isoformen, bietet neue therapeutische Angriffspunkte. Hierzu gehören insbesondere Voll-Längen p53 (FLp53), Δ40p53, Δ133p53 und Δ160p53. Neben den tumorsuppressiven und pro-apoptotischen Isoformen FLp53 und Δ40p53, induzieren Δ133p53 und Δ160p53 als negative Regulatoren anti-apoptotische Effekte. Wir haben ein neues Exon-spezifisches und Luziferase-basiertes Reportersystem entwickelt, welches erstmals die verschiedenen Isoformen FLp53, Δ40p53, Δ133p53 und Δ160p53 von p53 in lebenden Zellen und in Echtzeit nach Induktion durch Anti-Tumortherapeutika quantifizieren kann.

Ziele Steigerung des Erfolgs der CRC-Therapie durch die Bestimmung des zellulären p53 Isoform-Verhältnisses mit Hilfe von EXSISERS simultan zur Tumor-Behandlung.

Methodik Die Integration von drei Exon-spezifischen Intein-Luciferase-Reportersystemen (EXSISERS) in p53 der Modelzelllinie (HCT116) des Kolorektalen Karzinoms (CRC), ermöglicht die Differenzierung von drei Isoform Hauptgruppen (FLp53, Δ40p53, Δ133+Δ160p53). Zudem untersuchten wir die Wirkung von 4.863 Anti-Tumor Substanzen (MCE, HY-L025) auf die differenzielle Expression der p53-Isoformen in HCT116 Zellen in einem Hochdurchsatz Screening. Weiterhin haben wir die Wirksamkeit der identifizierten Therapeutika an Organoiden von PatientInnen mit CRC untersucht.

Ergebnisse Wir konnten zeigen, dass EXSISERS hinsichtlich der Anwendung und Zuverlässigkeit, Vorteile gegenüber konventionellen Protein-Nachweisverfahren (Western Blot und Massenspektrometrie) zeigt. Ein Hochdurchsatz-Screening mit EXSISERS, ermöglichte uns über 4.863 „small molecules“ hinsichtlich der p53 Isoform Induktion in CRC-Zelllinien zu untersuchen. Hier konnten wir neue Substanzen identifizieren, welche überwiegend tumorsuppressive p53 Isoformen hochregulieren und effizient Zelltod induzieren. Die Testung der identifizierten Substanzen in humanen CRC Organoiden, bestätigte zudem deren tumorspezifischen Effekt.

Schlussfolgerung Wir etablierten eine neue, im Hochdurchsatz-Screening anwendbare, Methode – EXSISERS – um p53 Protein-Isoformen in Echtzeit zu quantifizieren. Dies ermöglicht die Identifikation von Anti-Tumortherapeutika, welche pro-apoptotische p53 Isoformen induzieren und somit spezifisch Zelltod in Tumorzellen auslösen.

Publication History

Article published online:
28 August 2023