Ein neues Reportersystem zur Detektion von Zellen des kolorektalen Karzinoms anhand spezifischer Gen-Methylierungsmuster

Einleitung Das kolorektale Karzinom ist weltweit eine der häufigsten malignen Erkrankungen. Die Etablierung von Biomarkern zur molekularbiologischen Charakterisierung von Tumorgewebe ist eine Herausforderung aktueller Forschung und die Grundlage personalisierter Therapien. Epigenetische Veränderungen, allen voran DNA-Methylierung, stellen eine vielversprechende Option dar. Methylierungen betreffen CpG-Islands innerhalb Promotorregionen und führen so zu einer verminderten Expression von Tumorsuppressorgenen.

Ziele Ziel dieser Arbeit ist die Entwicklung eines Reportersystems, das (I) ein Screening für neue DNA-Methylierungsmarker ermöglicht und (II) Tumore hochspezifisch erkennen kann. Für diesen Ansatz geeignete Biomarker sollen durch Methylierungsanalyse von Zelllinien sowie Organoiden erkrankter Patienten identifiziert werden.

Methodik Unser Reportersystem besteht aus zwei Konstrukten. Ersteres erkennt mithilfe der Methyl-Binding-Domain des MBD1-Proteins hypermethylierte CpG-Islands. Das zweite Element ist so konzipiert, dass es sich über eine sgRNA einer dCAS9 an das Gen des Methylierungsmarkers anlagert. Binden beide in räumlicher Nähe, induziert eine SplitTEV-Protease die von uns entwickelte flipNLuc Luciferase. Die Lumineszenz wird zur Tumordetektion gemessen. Zusätzlich wurden mithilfe des Whole-Genome-Bisulfite-Sequencing die Karzinomzelllinien HCT116 und Caco-2 sowie Organoide aus Kolonbiopsien von Patienten mit kolorektalem Karzinom sequenziert.

Ergebnis Zunächst wurde die Induktion der flipNLuc durch die SplitTEV-Protease untersucht. Es zeigte sich ein signifikanter Lumineszenzanstieg, der die Funktionalität der Luciferase verifiziert. Weiterhin konnte das Reportersystem anhand der beim kolorektalen Karzinom hypermethylierten Gene EN1 und SCTR validiert werden. Im Vergleich mit den unmethylierten Genen GAPDH und GPI war eine signifikant erhöhte Lumineszenz nachweisbar. Zur weiteren Optimierung des Systems hinsichtlich Sensitivität und Spezifität konnten im Rahmen der bioinformatischen Analyse weitere differenziell methylierte Regionen identifiziert werden. Derzeit wird das Reportersystem zur Untersuchung dieser Gene modifiziert und somit deren Eignung als Biomarker validiert.

Schlussfolgerung Die entwickelte Methode ermöglicht die spezifische Detektion malignen Gewebes anhand hypermethylierter CpG-Islands. Sie kann darüber hinaus zum Screening für weitere Methylierungsmarker genutzt werden und ist auch auf andere Tumorentitäten übertragbar.

Publication History

Article published online:
28 August 2023