Differentielle Expression von p53-Proteinisoformen und deren Rolle bei der Pathogenese einer spontan bakteriellen Peritonitis (SBP)

Einleitung Die spontane bakterielle Peritonitis (SBP) ist eine lebensbedrohliche Komplikation der Leberzirrhose, die durch Translokation von Darmbakterien in die mesenterialen Lymphknoten verursacht wird. Bei Patienten mit Leberzirrhose erleichtert ein dünnerer Mukus den direkten Kontakt zwischen Bakterien und Darmepithelzellen, was zum Abbau von essenziellen Zell-Zell-Kontakt-Proteinen, Gewebeschäden und Induktion von zellulärem Stress führt. p53 ist ein wichtiger Regulator zellulärer Stressreaktion. Abhängig von den gebildeten Isoformen kann p53 dabei unterschiedliche Funktionen wahrnehmen. Wir untersuchen die Assoziation zwischen der Expression verschiedener Isoformen des Tumorsuppressorproteins p53 und bakteriell induziertem Zelltod mit Hilfe eines von uns neu entwickelten Luminiszenz-basierten Reportersystems (Truong et al. Nat Cell Biol 2021).

Material und Methodik Zur Quantifizierung der Expression von p53-Isoformen wurden exonspezifische Reportersysteme für die Expression von Isoformen (EXSISERS) in die TP53-Exons 2, 4 und 7 integriert, die es ermöglichen, drei Hauptgruppen von Isoformen (tumorsuppressives Vollängen-p53, Δ40p53, sowie onkogenes Δ133p53 und Δ160p53) in HCT116-Kolonkarzinomzellen zu unterscheiden. Die Verwendung von Split-Inteinen ermöglicht das Ausspleißen einer Luciferase aus dem entstehenden p53-Polypeptid, wodurch die Integrität der p53-Protein-Isoformen erhalten bleibt. Somit ist eine Bestimmung des zellulären Verhältnisses der p53-Protein-Isoformen möglich. HCT116 EXSISERS-Zellen wurden mit dem Referenzstamm Escherichia coli (E. coli) O6:Hnt sowie den aus dem Aszites von Patienten mit SBP isolierten E. coli Ont:H7 und Ont:H41 bis zu 4h kokultiviert. Die Isoform-Expression wurde durch Messung der Luciferase-Aktivitäten in Intervallen von 15 Minuten bis 2 Stunden mit Hilfe spezifischer Substrate quantifiziert. Zusätzlich wurden qPCR-Analysen zur Isoform-Expression durchgeführt. Das Zelltodverhalten wurde durchflusszytometrisch bestimmt.

Ergebnisse Alle verwendeten E. coli-Stämme führten zur Induktion von Zelltod in HCT116 EXSISERS-Zellen. In einer Ko-Kultur mit E. coli Ont:H7, die aus dem Aszites von Patienten mit Leberzirrhose isoliert wurden, wurde innerhalb von 15 Minuten (I) eine signifikante Hochregulation der Expression der △40p53-Isoform beobachtet. Dies führte (II) im Vergleich zu einer Ko-Kultur mit dem Referenzlaborstamm E. coli O6:Hnt zu einer beschleunigten Induktion des programmierten Zelltodes. Die Translation von Volllängen-p53, welches Zellzyklusarrest einleitet, blieb nach bakterieller Ko-Kultur unverändert. Gleichzeitig konnten wir über einen Zeitraum von 2 Stunden eine Abnahme der Translation der anti-apoptotischen und pro-onkogenen Isoformen △133p53 und △160p53 beobachten. Daher führte die Ko-Kultur mit SBP-assoziierten Bakterien in Darmepithelzellen zu einer Hochregulation von p53-Isoformen, die den Zelltod induzieren, während anti-apoptotische Isoformen herunterreguliert wurden. Diese Ergebnisse betonen die Bedeutung von p53 als einem wichtigen Regulator des durch Bakterien induzierten Zelltods bei einer SBP [1].

Zusammenfassung p53 spielt eine zentrale Rolle bei der SBP-Pathogenese. Direkter Kontakt von Epithelzellen mit Bakterien führt zu einer Induktion der pro-apoptotischen Isoform △40p53 und induziert Zelltod. Daher besteht bei SBP ein sensibles Gleichgewicht zwischen Zellüberleben und Zelltod im Darmepithel. Die identifizierte Induktion der Δ40p53-Isoform spielt eine entscheidende Rolle bei der Initiierung des Zelltods. Unser Ziel ist es, die Signalwege und Interaktionen zu entschlüsseln, die zur Aktivierung von Δ40p53 führen, um darauf aufbauend gezielte therapeutische Ansätze zum Schutz der epithelialen Barriere zu entwickeln.

• Literatur

• 1 Truong D.-J.J., Phlairaharn T., Eßwein B., Gruber C., Tümen D., Baligács E., Armbrust N., Vaccaro F.L., Lederer E.-M., Beck E.M.. et al. Non-Invasive and High-Throughput Interrogation of Exon-Specific Isoform Expression. Nat. Cell Biol. 2021; 23: 652-663

Publication History

Article published online:
13 May 2024