Ammoniak induziert NADPH-Oxidase 4- vermittelt oxidativen Stress in kultivierten Rattenastrozyten

Einleitung: Die hepatische Enzephalopathie (HE) ist ein im Gefolge akuter und chronischer Leberfunktionsstörungen auftretendes neuropsychiatrisches Syndrom. Sie ist die Folge einer zerebralen Hydratationsstörung (1) die vergesellschaftet ist mit einer erhöhten Expression von Biomarkern für oxidativen/nitrosativen Stress (2) und Seneszenz (3). In der vorliegenden Untersuchung wurde die Bedeutung der NADPH-Oxidase (NOX) 4 für durch Ammoniak in kultivierten Rattenastrozyten induzierten oxidativen/nitrosativen Stress und Seneszenz überprüft.

Material und Methoden: mRNA Expressionslevel von NOX4 und Growth Arrest and DNA Damage (GADD45) α wurden mittels Realtime-PCR quantifiziert. Die NOX4-Proteinexpression und oxidierte DNA/RNA (8-oxo-(deoxy)-guanosine/8OH(d)G) wurden durch Immunfluoreszenzanalyse nachgewiesen. Die Proliferation wurde durch fluorimetrische Quantifizierung der Hoechst34580 Fluoreszenz gemessen.

Ergebnisse: Unter Kontrollbedingungen wurde nur eine schwache anti-NOX4 Immunoreaktivität in kultivierten Rattenastrozyten beobachtet. Demgegenüber steigerte NH4Cl (5 mmol/l) nach 24, 48 und 72h die anti-NOX4 Immunoreaktivität insbesondere im Bereich des Zellkerns deutlich. Gleichzeitig wurde ein zeitabhängiger, signifikanter Abfall der NOX4 mRNA-Spiegel 24, 48 und 72h nach NH4Cl (5 mmol/l)-Exposition beobachtet. Gegenüber unbehandelten Kontrollen induzierte NH4Cl (5 mmol/l 24, 48 und 72h) eine deutliche Steigerung der anti-8OH(d)G Immunoreaktivität in kultivierten Astrozyten. Sowohl die durch NH4Cl (5 mmol/l 24, 48 und 72h)-gesteigerte anti-NOX4-, wie auch die anti-8OH(d)G-Immunoreaktivität waren hemmbar durch den Glutaminsynthetasehemmstoff Methionin-Sulfoximin (MSO). Durch Transfektion mit NOX4-spezifischer siRNA (80nmol/l, 72h) konnten die NOX4 mRNA Spiegel in kultivierten Rattenastrozyten um ca. 60% verringert werden und gleichzeitig die durch NH4Cl (5 mmol/l, 72h)-induzierte Steigerung der anti-NOX4- und anti-8OH(d)G-Immunoreaktivität deutlich vermindert werden. Die Transfektion kultivierter Rattenastrozyten mit NOX4-spezifischer siRNA hemmte die durch NH4Cl (5 mmol/l, 72h)-induzierte mRNA-Expressionssteigerung des zellzyklus-inhibitorischen Gens GADD45α und den damit assoziierten Proliferationsrückgang kultivierter Astrozyten.

Diskussion: Die Daten der vorliegenden Untersuchungen weisen auf eine wichtige Rolle der NOX4 für durch Ammoniak in kultivierten Rattenastrozyten induzierten oxidativen Stress und Astrozytenseneszenz.

Literatur:

[1] Häussinger D, Laubenberger J, vom Dahl S, Ernst T, Bayer S, Langer M, Gerok W, Hennig J. Proton magnetic resonance spectroscopy studies on human brain myo-inositol in hypo-osmolarity and hepatic encephalopathy. Gastroenterology. 1994; 107:1475 – 80.

[2] Görg B, Qvartskhava N, Bidmon HJ, Palomero-Gallagher N, Kircheis G, Zilles K, Häussinger D. Oxidative stress markers in the brain of patients with cirrhosis and hepatic encephalopathy. Hepatology. 2010; 52:256 – 65.

[3] Görg B, Karababa A, Shafigullina A, Bidmon HJ, Häussinger D. Ammonia-induced senescence in cultured rat astrocytes and in human cerebral cortex in hepatic encephalopathy. Glia. 2015; 63:37 – 50.

Korrespondierender Autor: Karababa, Ayse

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