Züchtung menschlichen Knorpelgewebes mit Hilfe einer Perfusionskammer

Zusammenfassung

Durch das begrenzte Angebot an frischem autologem Knorpeltransplantatgewebe wird in der rekonstruktiven Chirurgie im Kopfbereich oft auf avitales konserviertes Knorpelgewebe zurückgegriffen. Eine geeignete Methode zur in-vitro-Herstellung von Knorpelgewebe mit lebenden Zellen ist nur durch moderne Gewebekulturmethoden möglich, die die Erhaltung der phänotypischen Charakteristiken von Chondrozyten erlauben. Unter dieser Zielsetzung wurden menschliche Chondrozyten isoliert und in “low-melting” Agarose suspendiert. Das Konglomerat Zellen/Agarose wurde in eine Perfusionskammer für dreidimensionale Kultur eingebracht. Mit einer langsamen Peristaltikpumpe wurde in variablen Intervallen frisches Medium (Hams-F12 + 2% FCS + 50 µg/ml Ascorbinsäure) durch die Kammer mit einer Geschwindigkeit von 1 cm/h gepumpt. Der Differenzierungsgrad der Chondrozyten sowie die Proteoglykan- und Kollagen-Synthese wurde mit Hilfe von immunhistochemischen (APAAP-Immunfärbung) bzw. histochemischen (Azan-Färbung und Toloudin-Blau-Metachromasie) Methoden bestimmt. Die Chondrozyten behielten in dreidimensionalen Kultursystemen sowohl ihre morphologischen, phänotypischen als auch funktionellen Eigenschaften. Zusätzlich konnte eine Akkumulation von Matrixprodukten in der Umgebung der Zellen beobachtet werden. Diese Ergebnisse lassen den Schluß zu, dass durch dieses automatisierte dreidimensionale Kultur-Modell eine in-vitro-Herstellung von Knorpelgewebe für die Transplantation möglich ist.

Summary

In the field of otolaryngology cartilage grafting is commonly performed to reconstruct skeletal defects. Knowledge of chondrocyte growth and differentiation can now be used to engineer cartilage tissue for grafting. The first condition is that chondrocytes maintain their differentiated phenotype besides being able to produce a new cartilage matrix. The target of this study was to evelop a three-dimensional culture System for in-vitro formation of vital cartilage transplants. Chondrocytes were isolated by digesting the cartilage matrix with collagenase and hyaluronidase. After embedding in “low-melting” agarose, the chondrocytes were placed into a perfusion culture Chamber to provide a constant supply of nutrients to the cultures. The peristaltic pump was operated with on/off intervals of 30 min. Harn's F12 supplemented with 2% FCS and 50 µg/ml ascorbic acid was employed as culture medium. Monoclonal antibodies specific to collagens type I and type II were used to characterise cells and matrix synthesis. Synthesis of proteoglycans and collagens was achieved using toluidine blue and azan staining. Under the described culture conditions, the chondrocytes maintained a differentiated phenotype (expression of Collagen type II) with synthesis of collagens and proteoglycans. An accumulation of matrix products was achieved pericellularly. After 2-8 weeks the obtained tissue exhibited an excellent histological appearance showing the typical features of cartilage tissue. The results show that the perfusion Chamber allows a quick in-vitro fabrication of a piece of pure cartilage tissue for transplantation.

Schlüsselwörter

Knorpeltransplantation - Chondrozyten - Zell-Kultur

Key words

Cartilage grafting - Chondrocytes - Cell culture