Kommentar zu der Arbeit von C. Radtke et al.: Effiziente Herstellung transfizierter humaner Keratinozyten unter serum- und Feederlayer-freien Bedingungen

Innerhalb der Epidermis findet die Proliferation nur in der basalen Zellschicht der Keratinozyten statt, die der unterliegenden Basalmembran anhaften. Zellen, die die Basalmembran verlassen, gehen dann automatisch in die terminale Differenzierung, während sie nach oben zur Gewebeoberfläche wandern. Die Basalzellschicht enthält zwei Typen von proliferativen Keratinozyten: Stammzellen, welche eine unlimitierte Kapazität zur Selbsterneuerung besitzen, und transitorisch amplifizierende Zellen, also sog. Tochterzellen der o. g. Stammzellen, die dazu bestimmt sind, sich vom Zellzyklus zurückzuziehen und nach ein paar Runden der Zellteilung terminal zu differenzieren. Stammzellen exprimieren höhere beta-1-Integrin Level der extramzellulären Matrixrezeptoren als die transitorisch amplifizierenden Zellen. Dies kann dazu benutzt werden, die Keratinozyten-Subpopulationen zu isolieren und ihren Aufenthaltsort innerhalb der Epidermis zu bestimmen. Seit der bahnbrechenden Arbeit von Rheinwald und Green, die erstmals die serielle Kultivierung von humanen Keratinozyten in klinisch relevantem Umfang möglich machte [1] wurden unterschiedliche Verfahren zur Optimierung der Keratinozytenkulturen entwickelt. Der Einfluss von Wachstumsfaktoren, Hormonen und Calcium auf das Wachstum und die Differenzierung normaler humaner Keratinozyten war seither Gegenstand zahlreicher Untersuchungen [2] [3] [4] [5]. Um möglichst schnell nennenswerte Mengen an Keratinozyten innerhalb einer möglichst kurzen Zeit für die Behandlung von Verbrennungsopfern zu züchten, bediente man sich in der Regel sogenannter feeder layer, aus letal bestrahlten Mäusefibroblasten (murine 3T3 Zellen). Zudem wurde üblicherweise auch Serum hinzugegeben, um die optimalen Wachstumsbedingungen zu schaffen. Zunächst aus Gründen der wissenschaftlichen Reproduzierbarkeit wurde von unserer Arbeitsgruppe bereits zu Beginn der 90er Jahre experimentell und dann klinisch die serumfreie humane Keratinozytenkultur ohne feeder layer Zellen konsequent etabliert [6] [7]. Klinisch ist das insbesondere vor dem Hintergrund bedeutsam, dass anders als bei Verbrennungen bei nicht vitalen Erkrankungen (z. B. zur Therapie von chronischen Wunden) die potentiellen Nebeneffekte, die durch Verunreinigungen oder Serumbestandteile während der Kultivierung verursacht werden, stärker ins Gewicht fallen. Kommerziell sind mittlerweile eine Reihe serumfreier Kultursysteme erhältlich, wie sie auch in der vorliegenden Arbeit verwendet wurden. Durch den Verzicht auf Serum und die 3T3 Zellen nimmt man aber in Kauf, dass die Vermehrungsgeschwindigkeit etwas reduziert ist. Dies ist hauptsächlich für die Verbrennungsbehandlung wichtig. Andererseits wird die Hürde für die behördliche Zulassung durch serumfreie und fremdzellfreie Verfahren aber gesenkt. Dies ist wiederum von Bedeutung, weil die Europäische Union für potenzielle klinische Anwendungen derzeit neue Gesetze erarbeitet, die darüber entscheiden werden, wie realistisch der Einsatz solcher Techniken mit kultivierten Zellen für die tägliche klinische Praxis sein wird. Der ersten Euphorie nach Entdeckung der seriellen Keratinozytenkultur mit der großen Hoffnung, nun alle Wunden jeglicher Größe auf diese Weise einfach behandeln zu können, folgte Ende des letzten und Anfang dieses Jahrhunderts die Ernüchterung über die klinischen Ergebnisse und der Bankrott der führenden Biotechfirmen, obwohl diese teils von sehr großen Konzernen aufgekauft und unterstützt worden waren. Hier wird die Zukunft zeigen, was letztlich im klinischen Alltag Fuß fassen kann.

Within the epidermis proliferation only takes place in the basal cell layer of keratinocytes that attach to the underlying basement membrane. Once cells leave the basal membrane they automatically undergo terminal differentiation during their passage to the tissue surface. The basal cell layer contains two different types of proliferative keratinocytes: stem cells with an unlimited capacity of self renewal and transitory amplificating cells, so called daughter cells of the stem cells. These are determinded to withdraw from the cell cycle and after a a few rounds of replication undergo terminal differentiation. Stem cells express higher levels of beta-1-integrins of extracellular matrices than the transitory amplificating cells. This can be utilized to isolate the keratinocyte subpopulations and to determine their specific location within the epidermis. Different methods to optimize keratinocyte cultures have been developed since the ground breaking work of Rheinwald and Green [1] that allowed for serial cultivation of human keratinocytes in a clinically relevant quantity. The influence of growth factors, hormones and calcium on the growth and differentiation of normal human keratinocytes has been subject to numerous investigations [2] [3] [4] [5]. In order to obtain significant amounts of keratinocytes as quickly as possible to treat burn victims initially so called feeder layers of lethally irradiated mouse fibroblasts (murine 3T3 cells) were used. In addition usually serum was added to create an optimal environment for the cell growth.

Initially for reasons of scientific reproducibility our group introduced serum free and feeder layer cell free keratinocyte cultures experimentally and then clinically in the early 90s [6] [7]. This is of relevance given the clinical background that, in contrast to burns, all potential side effects induced by serum fractions or contaminations weigh heavier in non vital transplantation indications (such as chronic wounds). Meanwhile a number of serum free culture systems are commercially available, like the one used in this paper.

In return for omitting serum and 3T3 cell feeder layers one has to accept that the cell multiplication time is somewhat prolonged. This is important for treating burns. On the other hand the hurdle for the governmental product accreditation is lowered by using serum free and 3T3 cell free techniques. This is important because the European Union is currently generating new legal conditions for potential clinical applications, which will decide how realistic the clinical use of such techniques with cultured cells will be within the daily practice. The first euphoria after the invention of serial keratinocyte cultivation with the great hope that from now on all wounds of any size could be treated easily with this method, was followed by a disillusionment at the end of the last and the beginning of this century about the true clinical results with the consequent bankruptcy of the leading biotech firms, although these had been taken over and substituted by large pharmaceutical companies. Future will have to show what finally will be a consolidated part in our day to day clinical routines.

Schlüsselwörter

experimentelle Chirurgie - primäre Verbrennungschirurgie - Verbrennungsintensivmedizin - Verbrennungschirurgie

Key words

experimental surgery - primary burns surgery - burns intensive care - burns surgery -

Literatur

• 1 Green H, Rheinwald JG, Sun TT. Properties of an epithelial cell type in culture: the epidermal keratinocyte and its dependence on products of the fibroblast.  Prog Clin Biol Res. 1977;  17 p. 493-500
• 2 Bleiziffer O, Horch RE, Hammon M. et al . T17b murine embryonal endothelial progenitor cells can be induced towards both proliferation and differentiation in a fibrin matrix.  J Cell Mol Med. 2009;  13 ((5)) p. 926-935
• 3 Horch RE, Koop J, Kneser U. et al . Tissue engineering of cultured skin substitutes.  J Cell Mol Med. 2005;  9 ((3)) p. 592-608
• 4 Hutmacher DW, Horch RE,, Loessner D. et al . Translating Tissue Engineering Technology Platforms into Cancer Research.  J Cell Mol Med. 2009; 
• 5 Polykandriotis E, Euler S, Arkudas A. et al . Regression and Persistence: Remodelling in a Tissue Engineered Axial Vascular Assembly.  J Cell Mol Med. 2009; 
• 6 Horch RE, Bannasch H, Koop J. et al . Single-cell suspensions of cultured human keratinocytes in fibrin-glue reconstitute the epidermis.  Cell Transplant. 1998;  7 ((3)) p 309-317
• 7 Bannasch H, Unterberg T, Föhn M. et al . Cultured keratinocytes in fibrin with decellularised dermis close porcine full-thickness wounds in a single step.  Burns. 2008;  34 ((7)) p 1015-1021

Korrespondenzadresse