Wirkung eines zyklischen N-Lost-Phosphamidesters auf experimentell erzeugte Tumoren der Ratte¹

Zusammenfassung

Man versucht heute Zytostatika zu entwickeln, die in einer gut verträglichen Form appliziert werden („Transportform”) und erst im pathologischen Gewebe, in der Geschwulst, in die aktive wirksame Substanz übergeführt werden („Wirkform”). Dieses Prinzip hat sich erstmals bei der Behandlung des Prostata-Karzinoms mit Stilböstroldiphosphat klinisch bewährt. Bei Stickstofflost-Verbindungen ist die biologische Wirksamkeit von der Reaktivität der funktionellen ß-Chloraethyl-Gruppen abhängig. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Prinzip „Transportform - Wirkform” auf die alkylierenden Substanzen zu übertragen. Es gelang, durch chemische Substitutionen, unter Verminderung der Basizität des zentralen Stickstoffatoms, inaktive Transportformen herzustellen, bei denen erst chemische Umwandlungen im Organismus zu einer Aktivierung der β-Chloraethyl-Gruppen und damit zur Freisetzung der Wirkform führen. Als Maß der Reaktivität wurde die Chlorionen-Dissoziation bestimmt. Arnold und Bourseaux synthetisierten eine Reihe von N-Lost-Phosphamiden, insbesondere von zyklischen Phosphamidestern. Unter zahlreichen synthetisierten und geprüften Verbindungen zeichnete sich das N,N-Bis-(β-chloraethyl)-N′,O-propylen-phosphorsäureester-diamid (B 518-ASTA bzw. Endoxan^®) durch besonders günstige Eigenschaften aus. Im Vergleich mit N-Oxyd-Lost und vor allem mit N-Lost ist die Reaktivität der funktionellen β-Chloraethyl-Gruppen stark herabgesetzt. Unter in-vitro-Bedingungen beträgt die C1¯-Dis-soziation aus B 518 während drei Stunden weniger als 0,05 Äquivalent pro Mol. Im Inkubationstest von Schmähl und Druck-rey erwies sich B 518 auch bei 37^° C praktisch als inaktiv. Die pharmakologische Prüfung erfolgte nach den Kriterien von Druckrey an verschiedenen Rattentumoren (u. a. Yoshida-Aszites-Sarkom, Walker-256-Karzinom, Jensen-Sarkom und DS-Karzino-sarkom). Bewertet wurde die endgültige Heilung in einer Beobachtungszeit von 90 Tagen. Sowohl für die kurative als auch für die letale und leukotoxische Wirkung wurden die Dosis-Wirkungsbeziehungen durch Aufnahme der entsprechenden Regressionsgeraden ermittelt. Am Yoshida-Aszites-Sarkom zeigte B 518 bei einmaliger intravenöser Gabe mit einem Therapeutischen Index von 8,5 gegenüber 2,2 beim N-Oxyd-Lost eine wesentlich größere therapeutische Breite. Auch bei fraktionierter Anwendung war der Index eindeutig größer als beim N-Oxyd-Lost und als bei allen anderen vergleichend geprüften Substanzen. Die Ergebnisse des Simultanversuches konnten bei der Behandlung subkutan wachsender Geschwülste im echten Therapieversuch bestätigt werden. Als besonderer Fortschritt wird festgestellt, daß mit B 518 eine signifikante Beeinflussung des DS-Karzino-sarkoms zu erzielen war, eines Tumors, der sich bisher chemotherapeutisch als völlig resistent erwiesen hat. Zur Charakterisierung der Knochenmarksschädigung wurde eine Senkung der Leukozyten bei den Versuchstieren um mindestens 50% bewertet; die Wahrscheinlichkeit einer leukotoxischen Belastung für eine kurativ vollwirksame Dosis von B 518 beträgt nur 12% (N-Oxyd-Lost 86%). Da B 518 im Tierversuch eine sehr gute kanzerotoxische Wirkung zeigt, unter in-vitro-Bedingungen jedoch inaktiv ist, erscheint die Annahme berechtigt, daß die Wirkung nach dem Prinzip „Transportform - Wirkform” erfolgt. Hierfür spricht auch die therapeutische Breite und die geringe leukotoxische Wirkung.

Summary

Recently many trials have been made to develop cytostatic agents which can be administered in a well tolerated form (“transport form”) and which are activated (“active form”) in the organism, particularly in the tumour tissues. This principle has proved its value for the first time in the treatment of prostatic carcinoma with stilboestrol diphosphate. The biological activity of nitrogen mustard compounds depends on the reactivity of the functional β-chlorethyl groups. It was tried to appli-cate the principle of “transport form” — “active form” on the alkylating agents. By chemical substitution — reducing the basicity of the central nitrogen atom — it was possible to obtain inactive transport forms in which the β-chlorethyl groups are activated by chemical transformation in the organism which finally leads to liberation of the active form. To measure the reactivity the dissociation of the chlorine ions was determined. Arnold and Bourseaux synthesised various nitrogen mustard phosphamides, especially of cyclic phosphamide esters. Numerous compounds were synthesised and tested of which the N,N-Bis-(β-chlorethyl) - N′, O-propylene-phosphoric acid ester diamide (B 518-ASTA, Endoxan respectively) was found to be most useful. Compared with N-oxide of nitrogen mustard and especially with nitrogen mustard the reactivity of the functional β-chlorethyl groups is markedly reduced. In vitro B 518 showed a dissociation of Cl¯ less than 0.05 equivalent/mol. in 3 hours. In the incubation-test of Schmähl and Druckrey B 518 remained practically inactive, even at 37° C. B 518 was tested pharmacologically in rats with well defined tumours (Yoshida ascites sarcoma, Walker-256-carcinoma, Jensen sarcoma and DS carcinosarcoma) following the criteria of Druckrey. The assessment of the curative effect was based on the definite healing of the animals after 90 days. For the curative and also for the lethal and leucotoxic action the dose-action relationship was ascertained by straight lines. On the Yoshida ascites sarcoma, treated with a single intravenous dose, B 518 had a therapeutic index of 8.5 (N-oxide of nitrogen mustard = 2.2); this means a considerably wider margin of safety. Also when administered fractionally the therapeutic index of B 518 was obviously larger than with N-oxide of nitrogen mustard and with all other tested compounds. Not only when given simultaneously with the inoculation of tumour cells, but also in the treatment of sub-cutaneously growing tumours B 518 was found to be highly effective. The fact that B 518 successfully inhibited the growth of the DS carcinosarcoma in rats which is resistant against all other known cytostatic agents, has to be considered as a remarkable progress. The lesion of the bone marrow was characterized by depression of the leucocytes for at least 50%. The curative dose of B 518 (DC₉₅) produces leucotoxic side-effects with a probability of 12% (N-oxide of nitrogen mustard = 86%). As B 518 showed a high cancerotoxic action in animal experiments, but at the same time was inactive in vitro, it can be assumed that the action follows the principle of “transport form” — “active form”. This is also indicated by the wide margin of safety and the low leucotoxic activity.

Resumen

El efecto de un N-Lost-fosfamida-éster cíclico sobre tumores de la rata producidos experimentalmente

Se ensaya actualmente el desarrollo de citostáticos aplicables en una forma bien soportada («forma de transporte»), que no se convierten en substancia eficaz activa («forma eficaz») sino en el organismo, sobre todo en el tejido de tumor. Este principio fué realizado por vez primera de un modo prácticamente eficaz en el tratamiento del carcinoma de la próstata con Stilboestrol-difosfato. En compuestos de Lost nitrogenado, la eficacia biológica depende de la reactividad de los grupos funcionales de beta-cloruro de etilo. El presente trabajo tenía por objeto aplicar el principio de «forma de transporte — forma eficaz» a las substancias alquilantes. Por medio de sustituciones químicas y reduciendo la basicidad del átomo de nitrógeno central se logro producir formas de transporte inactivas, en las cuales solo transformaciones químicas en el organismo causan una activación de los grupos de beta-cloruro de etilo y con ello la liberación de la forma eficaz. Como medida de la reactividad quedó determinada la disociación de iones de cloro. Arnold y Bourseaux sintetizaban una serie de N-Lost-fosfamidas, especialmente de fosfamida-ésteres cíclicos. Entre numerosos compuestos sintetizados y comprobados se distinguía la N,N-bis(beta-cloruro de etilo)-N′, O-propileno-éster fosfórico-diamida (B 518-ASTA o «Endoxan») por sus cualidades especialmente favorables. En comparacion con el N-óxido-Lost y ante todo con el N-Lost, la reactividad de los grupos funcionales de beta-cloruro de etilo está muy reducida. En condiciones «in vitro», la disociación de Cl¯ del B 518 importa durante tres horas menos de 0,05 de equivalente por cada mol. En la prueba de incubación de Schmähl y Druckrey resultó el B 518 prácticamente inactivo también a 37° C. La comprobación farmacológica se practicó según los criterios de Druckrey en diferentes tumores de ratas (entre otros sarcoma ascítico de Yoshida, carcinoma de Walker 256, sarcoma de Jensen y carcinosarcoma DS). La curación definitiva fué valorada en un período de observación de 90 días. Las relaciones entre dosis y efecto fueron averiguadas aplicando la correspondiente recta de regresión, tanto para el efecto curativo como para el mortal y leucotóxico. El B 518 mostró en el sarcoma ascítico de Yoshida, después de una sola medicación intravenosa, una amplitud terapéutica mucho mayor que el N-óxido-Lost, con un índice terapéutico de 8,5 frente a 2,2, El índice era también en aplicaciones fraccionadas inequívocamente mayor que en el N-óxido-Lost y todas las demás substancias examinadas para fines comparativos. Los resultados del ensayo simultáneo podían ser confirmados en el tratamiento de tumores de crecimiento subcutáneo en un auténtico experimento terapéutico. Como progreso particular se comprueba que con el B 518 se podía lograr influir de un modo significante en el carcinosarcoma DS, un tumor que hasta ahora resultaba completamente resistente a la quimioterapia. Para caracterizar la lesión de la médula ósea se valoró un descenso de los leucocitos en los animales de experimentación en 50% por lo menos; la probabilidad de una tara leucotóxica de una dosis de B 518 de eficacia curativa completa importa sólo 12% (N-óxido-Lost alrededor del 86%). Puesto que el B 518 muestra en la experimentación animal un efecto cancerotóxico muy bueno, mientras que en condiciones «in vitro» es inactivo, parece justificada la hipótesis de que el efecto resulta según el principio de «forma de transporte — forma eficaz»). A favor de la misma hablan también la amplitud terapéutica y la escasa acción leucotóxica.