Nachweis von Seneszenz-assoziierten Heterochromatinfoci in humanen Lungenfibroblasten – methodische Aspekte

Einleitung: In Kernen von seneszenten Zellen bilden sich Heterochromatin-Domänen aus, die durch Anfärbung mit DAPI und Fluoreszenzmikroskopie nachweisbar sind („SAHF“, Senescence-Associated Heterochromatin Foci [Narita, Cell 2003]). Im Vergleich zur Detektion seneszenter Zellen durch die Anfärbung von ß-Galactosidase (Dimri, PNAS 1995), ist der Nachweis von SAHF weniger zeitaufwendig und die SAHF-Bildung zudem mechanistisch direkter an der zellulären Seneszenz beteiligt (Narita, BJC 2007).

Methode: Humane Lungenfibroblasten wurden auf Deckgläschen eingesät (40.000/well) und SAHF während der Alterung in Kultur, sowie nach Exposition gegenüber H₂O₂ (10 oder 50µM) gemessen. Drei primäre Zelllinien wurden 2h oder 2d exponiert und sowohl 24h, als auch 48h nach Belastung geerntet. Die Kernfärbung der Zellen erfolgte mit DAPI/Methanol-Lösung (1µg/mL, 15min, 37°C). Die Deckgläser mit den gefärbten Zellen wurden auf Objektträger montiert und die Anzahl der Zellkerne mit SAHF von zwei Auswertern ermittelt.

Ergebnisse: Während der Alterung von humanen Lungenfibroblasten in Kultur zeigte sich ein Anstieg der SAHF-positiven Zellen, der allerdings nicht über alle Passagen kontinuierlich verlief (evtl. Verlust seneszenter Zellen beim Passagieren). Ein reproduzierbarer Anstieg der Zahl SAHF-positiver Zellen im Vergleich zu nicht exponierten Kontrollkulturen war 48h nach 50µM H₂O₂ zu beobachten. 10µM H₂O₂ hatte keinen Effekt. Die Belastung für 2d oder die Messung 24h nach Belastung zeigte uneinheitliche Daten bzw. keine Veränderung der Zahl der SAHF-positiven Zellen. Die Ergebnisse der zwei Auswerter waren nur mäßig miteinander korreliert.

Diskussion: Der Nachweis von SAHF in kultivierten Lungenfibroblasten ist möglich. Sowohl die Alterung in Kultur, als auch die induzierte Seneszenz sind nachweisbar. Probleme können aber z.B. durch den selektiven Verlust von seneszenten Zellen in Kultur auftreten. Die Identifikation von SAHF kann durch verschiedenen Stadien des Zellzyklus und durch Apoptose erschwert werden, insbesondere sind die Anfangsstadien der Prophase mit SAHF verwechselbar. Die Schwierigkeiten in der Identifikation und Quantifikation von SAHF spiegelte sich auch in der nur mäßigen Korrelation zwischen den unabhängigen Auswertern wider.

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