Validation of a Simple Bioanalytical Method for the Determination of DRF-6196, a Novel Oxazolidinone, in Mouse Plasma

Summary

An isocratic simple, specific, sensitive and reproducible high performance liquid chromatography (HPLC) method was developed and validated for the estimation of DRF-6196, a novel oxazolidinone in mouse plasma. This method involves a simple liquid/liquid extraction of DRF-6196 and the internal standard (IS; chlorzoxazone, CAS 95-25-0) from plasma into dichloromethane/ethyl acetate mixture that was evaporated under nitrogen. The HPLC analysis was carried out on an Inertsil ODS 2 column using 0.01 mol/L potassium dihydorgen ortho phosphate (pH 3.2) and acetonitrile (65:35, v/v) as mobile phase. The eluate was monitored using an UV detector set at 266 nm. Ratio of peak area of analyte to IS was used for quantification of plasma samples. The retention time of DRF-6196 and IS were 8.2 and 11.1 min, respectively. The assay was linear (r² > 0.999) in the concentration range 0.1-50 µg/ml. Absolute recovery for analyte and IS was > 94 % from mouse plasma. The lower limit of quantification (LLOQ) of DRF-6196 was 0.1 µg/ml. The inter- and intra-day precision in the measurement of quality control (QC) samples, 0.1, 0.3, 15.0 and 40.0 µg/ml, were in the range 3.64 to 9.51 % relative standard deviation (RSD) and 0.92 to 6.23 % RSD, respectively. Accuracy in the measurement of QC samples was in the range 88.15 to 106.05 % of the nominal values. The analyte and IS were stable in the stability studies viz., benchtop, autosampler and freeze/thaw cycles. The stability of DRF-6196 was established for 1 month at −80 °C. The assay method was successfully applied to a pharmacokinetic study of DRF-6196 in mice.

Zusammenfassung

Validierung einer einfachen bioanalytischen Methode zur Bestimmung des neuen Oxazolidinons DRF-6196 im Plasma von Mäusen / Anwendung in einer pharmakokinetischen Einzeldosis-Studie

Es wurde eine einfache, spezifische und empfindliche isokratische HPLC-Methode zur Bestimmung von DRF-6196, einem neuen Oxazolidinon, im Plasma von Mäusen entwickelt und validiert. Das Verfahren verwendet eine einfache Flüssig/ flüssig-Extraktion von DRF-6196 und dem internen Standard (Chlorzoxazon, CAS 95-25-0) mittels Dichlormethan/Es-sigsäureethylester und Einengen unter Stickstoff. Die HPLC-Analyse erfolgt mit einer Inertsil ODS 2-Säule mit 0,01 mol/l Kaliumdihydrogenorthophosphat (pH 3,2) und Acetonitril (65:35, v/v) als mobiler Phase. Zur Detektion wird ein UV-Detektor bei 266 nm eingesetzt. Zur Quantifizierung wird das Peakflächenverhältnis des Analyten zum internen Standard herangezogen. Die Retentionszeiten von DRF-6196 und dem internen Standard betragen 8,2 bzw. 11,1 min. Die Bestimmung ist im Konzentrationsbereich 0,1 bis 50 µg/ml linear (r² > 0,999). Die absolute Wiederfindungsrate aus dem Mäuseplasma liegt bei > 94 % für DRF-6196 und den internen Standard. Die untere Bestimmungsgrenze (LLOQ) von DRF-6196 beträgt 0,1 µg/ml, die Präzisionen in der Serie bzw. von Tag zu Tag bei QC-Kontrollen (0,1, 0,3, 15,0 und 40,0 µg/ml) liegen zwischen 3,64 und 9,51 % (RSD) und die relative Standardabweichung (RSD) im Bereich 0,92 bis 6,23 %. Für die Genauigkeit im Bereich der QC-Proben wurden Werte zwischen 88,15 und 106,05 % ermittelt. DRF-6196 und interner Standard waren im Verlauf umfangreicher Studien stabil, für DRF-6196 konnte eine Stabilität von einem Monat bei −80 °C ermittelt werden. Das Verfahren wurde auf pharmakokinetische Studien von DRF-6196 bei Mäusen erfolgreich angewendet.

Key words

DRF-6196, determination in plasma, method validation, mice, pharmacokinetics - Oxazolidinone derivative