In vitro Evaluation of the Anti-prionic Activity of Newly Synthesized Congo Red Derivatives

Summary

“Transmissible Spongiform Encephalopathies” (TSE) are a group of degenerative progressive fatal disorders of the CNS, affecting both humans and animals. The main pathogenic event is the conversion of cellular prion protein from the normal, enzyme-sensitive (PrP^sen), to the insoluble proteinase K-resistant isoform (PrP^res). Since the new juvenile variant of Creutzfeldt-Jakob disease (vCJD) is probably due to the transmission of Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE) prion protein to man, therapeutic and preventive compounds for animals and humans are urgently needed.

Congo Red (benzidine-diazo-bis-1-naphthylamine-4-sulfonic acid sodium salt, CAS 573-58-0, CR), an azoic dye that inhibits amyloid deposition, and some newly synthesized derivatives, more lipophilic and less toxic, were tested for their anti-prionic activity, in different experimental models.

Cell-free experiments using the synthetic peptide PrP 106−126, homologous to amino acid residues 106−126 of the human PrP, were run to determine the antiamyloidogenic properties of some of the molecules. Peptide solutions containing each compound were incubated at 37 °C, for increasing times, to analyse the kinetics of aggregation of PrP 106−126 peptide. After incubation, the amount of non-aggregated peptide was measured by RP-HPLC. While CR enhanced the amyloidogenicity of PrP 106−126, derivatives “1a” and “1b” both showed the opposite behaviour, reducing aggregation by 15−20 %.

In other experiments using electron microscopy PrP 106−126 was assayed with the same molecules to assess the number and size of fibrils formed. CR showed its typical interaction, producing amyloid aggregates; “1a” did not interfere with fibril formation, while “1b” seemed to partially affect the structure of PrP 106−126 fibrils.

Using a different cell-free model, it was investigated whether CR derivatives could reverse the protease-resistant PrP^res, extracted from Syrian hamster infected brain, into the normal protease sensitive PrP^sen. Samples containing fixed amounts of PrP^res were incubated at 37 °C for 1 h with all the newly synthesized molecules, at concentrations ranging from 50 µg/mL to 750 µg/mL. After treatment with proteinase K, half of each sample was incubated with 3 mol/L guanidine thiocyanate in order to exclude over-stabilisation of the PrP^res aggregates already observed with CR. The remaining amount of PrP^res was assessed by Enhanced Chemoluminescence (ECL) Western blotting analysis. None of the compounds induced the reversion of PrP^res to PrP^sen; nevertheless, 6 of the 8 molecules interacted with PrP^res molecules, over-stabilising the PrP^res aggregates, from this aspect being similar to CR in activity.

Finally, the inhibition of the generation of PrP^res in the S12 clone of a mouse neuroblastoma cell line (N2a S12), persistently infected by the mouse adapted Chandler strain of scrapie, was evaluated. Increasing amounts of CR, “1a” and “1b” were added to the culture medium at each cell passage. After various days of treatment, the cells were collected, lysed, and the amount of PrP^res was assayed by ECL Western blotting after PK treatment. As expected, there was a decrease in pathological PrP expression starting from the 4th day of treatment, with 5 and 10 μg/mL CR; PrP^res completely disappeared after respectively 10 and 14 days of treatment. “1a” was strongly effective after 3 days of treatment at 5 and 10 μg/mL, but it was also highly toxic; at the concentration of 1 μg/mL, it had a mild inhibitory effect after 8 days.

The reduction of PrP^res was also evaluated by intracytoplasmic flow-cytometry immunofluorescence on CR- and “1a”-treated N2a S12 cells. CR induced a doserelated decrease of PrP expression from day 3 to 13 of treatment. At the concentrations of 2 and 1.5 μg/mL “1a” also strongly affected the expression of PrP starting from the 3rd day of treatment until the end of the experiment (day 13).

These results confirm the importance of using an integrated system, based on different experimental models, to obtain useful information on the mechanism of action of anti-prionic compounds.

Zusammenfassung

Bewertung der antiprionischen Wirkung in vitro von neu synthetisierten Kongo-Rot-Derivaten

Unter dem Begriff „transmissible spongiforme Enzephalopathien” (TSE) wird eine Reihe von degenerativen, progressiven, tödlichen Krankheiten des zentralen Nervensystems zusammengefaßt, die sowohl bei Mensch als auch beim Tier auftreten können. Als wichtigster pathogenetische Mechanismus spielt dabei die Konversion des normalen, enzymsensiblen Prion-Proteins (PrP^sen) in eine unlösliche, Porteinase-K-resistente Isoform (PrP^res) eine primaere Rolle. Für die neuerdings aufgetretene juvenile Variante der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (vCJD) ist wahrscheinlich die Übertragung des BSE (bovine spongiforme Enzephalopathie)-Prion-Proteins auf den Menschen verantwortlich. Deshalb ist die Forderung nach therapeutischen und vorbeugenden Substanzen, die bei Tier und Mensch angewendet werden können, höchst wünschenswert.

In der vorliegenden Studie wurden Kongo-Rot (Natriumsalz der Benzidindiazo-bis-1-naphthylamin-4-sulfonsäure, CR), ein Azofarbstoff, welcher die Ablagerungen von Amyloiden verhindert, sowie neuere synthetische lipophile und weniger toxische Derivate dieses Farbstoffes auf ihre antiprionischen Eigenschaften an verschiedenen Versuchsmodellen untersucht.

Wir haben in zellfreien Versuchen das synthetische Peptid PrP 106−126, das den Aminosäurengruppen 106−126 des menschlichen PrP verwendet, um die antiamyloidogenen Eigenschaften der verschiedenen Versuchsmolekuele testen zu können. Peptidlösungen, die die verschiedenen Verbindungen enthielten, wurden bei 37 °C und steigender Zeitdauer inkubiert, um die Kinese der Aggregation des Peptides PrP 106−126 zu analysieren. Am Ende der jeweiligen Inkubationszeit wurde die Menge des nicht gebundenen Peptids mittels Rp-HPLC gemessen. Die Ergebnisse zeigen, daß, während Kongo-Rot die Eigenschaften von PrP106−126, Amyloide zu bilden, noch fördert, beide Derivate, sowohl „1a” als auch „1b”, gegenteilig wirken. Sie reduzieren die Bildung der Aggregate um ca 15−20 %. In einer zweiten Versuchsreihe, durchgeführt mittels eines Elektrononmikroskops, wurde PrP106−126 in Anwesenheit der zu testenden Substanzen beobachtet, um die Anzahl und die Dimension der gebildeten Fibrillen bestimmen zu können. Kongo-Rot (CR) zeigte seine typische Eigenschaft, die Aggregatsbildung zu fördern; „1-a” beeinflußte die Fibrillenbildung nicht, während „1-b” scheinbar die Fibrillenstruktur von Prp106−126 teilweise aggrediert.

In einer weiteren zellfreien Testreihe wurde zu untersucht, ob die CR-Derivate das aus infizierten Hirnen von syrischen Hamstern gewonnene Protease-resistente PrP^res wieder in normales PrpSEN umzuwandeln vermögen. Proben, die eine konstante Konzentration enthielten, wurden bei 37 °C 1 h mit den jeweiligen neu synthetisierten Molekülen in verschiedenen Konzentrationen (50 µg/mL − 750 µg/mL) inkubiert. Nach einem Verdauungsprozeß durch Proteinase K wurde die Hälfte jeder Probe mit 3-mol/L-Guanidinthiocyanat angesetzt, um ausschließen zu können, daß eine Überstabilisierung von PrP^res stattgefunden hatte, wie das bei den Tests mit CR geschehen war. Das restliche PrP^res wurde mit Hilfe des ECL (Enhanced Chemioluminescence) Western Blot analysiert. Keine der untersuchten Substanzen konnte PrP^res in PrP^sen zurückverwandeln. Sechs der acht untersuchten Moleküle dieser Versuchsreihe interagierten mit PrP^res-Molekülen, indem sie eine Überstabilisierung herbeiführten, ähnlich wie das schon bei der Reaktion mit CR der Fall war.

In einer letzten Versuchsreihe wurde die Inhibition der Bildung von PrPres in einem S12Klon, der aus Mäuse-Neuroblastom-Zellinien (N2a S12) isoliert worden war, untersucht. Dieser S12-Klon war dauerhaft mit dem an Mäuse angepaßten Chandler-Stamm der Scrapie infiziert worden. CR, „1-a” und „1-b” wurden dem Nährmedium bei jeder Zellpassage in immer höherer Menge zugefügt. Nach mehrtägiger Behandlung wurden die Zellen isoliert, lysiert und die Menge von vorhandenem PrPres mit Hilfe des Western Blot nach einer PK-Verdauungsphase gemessen. Wie erwartet sank die Konzentration von pathologischer PrPres-Epression nach Behandlung mit CR (sowohl bei 5 µg/mL als auch bei 10 µg/mL) ab dem 4. Behandlungstag. Vollständig war das PrP nach 10 Tagen bei einer Konzentration von 5 µg/mL und nach 14 Tagen bei einer Konzentration von 10 µg/ mL CR verschwunden. „1-a” war in beiden Konzentrationen schon nach 3 Tagen wesentlich wirksamer, erwies sich jedoch als hochtoxisch. In einer Konzentration von 1 µg/mL wies „1-a” nach 8 Tagen eine leichte Hemmwirkung auf.

Key words

Bovine spongiform encephalopathy (BSE) - CAS 573-58-0 - Congo Red, anti-prionic activity, in vitro studies - Prion protein