Lekteplase — a Secreted Tissue Plasminogen Activator Derivative from Escherichia coli

Summary

Fermentation studies of batch-mode cultivation in 4-L fermenters were carried out to obtain an active recombinant DNA-derived tissue plasminogen activator (t-PA) deletion mutant, lekteplase, secreted and correctly folded from Escherichia coli. The OmpA signal sequence was used to deliver the heterologous product composed of kringle 2 plus serine protease domain (K₂S) to the medium. Supplementing the complex medium with 10 % glycerol and 20 mmol/l magnesium chloride led to an increase in cell numbers with final cell density reaching an OD₆₀₀ of 24. The expression level of lekteplase in the medium detected by Sandwich ELISA was 100 mg/L. Enzymatic activity of lysine-sepharose purified product was demonstrated by amidolytic assay, in vitro fibrin clot lysis, and copoly-merization PAGE.

Zusammenfassung

Lekteplase — ein sezerniertes Gewerbe-Plasminogen-Aktivator-Derivat aus Escherichia coli

Fermentationsexperimente im Batch-Verfahren wurden im 4-Liter-Fermenter durchgeführt, um eine aktive rekombinante Deletionsmutante von Gewebe-Plasminogen-Aktivator (t-PA) mit der Bezeichnung Lekteplase gentechnisch herzustellen und aus Escherichia coli zu sezernieren. Die OmpA-Signalsequenz wurde verwendet, um das heterologe Produkt, bestehend aus Kringel 2 und der Serin-Protease-Domäne (K₂S) in das Medium zu sezernieren. Der Zusatz von 10 % Glycerol und 20 mmol/1 Magnesium chlorid zu dem komplexen Nährmedium führte zu einer Zunahme der Zellzahl mit einer Zelldichte von OD₆₀₀ = 24. Der Expressionstiter von korrekt gefaltetem K₂S im Medium wurde durch Sandwich-ELISA mit 100 mg/l bestimmt. Die enzymatische Aktivität des Lysin-Sepharosegereinigten Produkts wurde im amidolytischen Test, durch In-vitro-Thrombolyse und Copolymersations-PAGE nachgewiesen.

Key words

Escherichia coli - Lekteplase - Reteplase - Serine protease - t-PA deletion mutant - Tissue plasminogen activator, kringle 2, secretory pathway