Radioligand Binding Assays in the Drug Discovery Process: Potential Pitfalls of High Throughput Screenings

Summary

Radioligand binding assays evaluating directly the ability of a drug to interact with a defined molecular target is part of the drug discovery process. The need for a high throughput rate in screening drugs is actually leading to simplified experimental schemes that increase the probability of false negative results. Special concern involves voltage- gated ion channel drug discovery where a great care is required in designing assays because of frequent multiplicity of (inter-acting) binding sites. To clearly illustrate this situation, three different assays used in the academic drug discovery program of the authors were selected because they are rich of intrinsic artifacts: (I) (20 mmol/1 caffeine almost duplicated [³H]ryanodine binding (89 % higher than control) to rat heart microsomes at 0.3 µmol/l free calcium but did not exert any effect when using a high (107 µmol/l) free calcium, as mostly used in ryanodine binding assays; (II) An agonist for the ionotropic glutamate receptor of the kainate type can distinctly affect [³H]kainate binding to chicken cerebellum membranes depending on its concentration: unlabelled kainic acid perse either stimulated about 30 % (at 50–100 nmol/l), had no effect (at 200 nmol/l) or even progressively decreased (at 0.3-2 µmol/l) the binding of 5 nmol/l [³H]kainate, emphasizing the risk of using a single concentration for screening a drug; (III) In a classical [³H]flunitrazepam binding assay, the stimulatory effect of a GABA (γ- aminobutyric acid) agonist was only observed when using extensively washed rat brain synaptosomes (10µmol/l GABA increased flunitrazepam binding by 90 %). On the other hand, the inhibitory effect of a GABA antagonist was only observed when using crude synaptosomes (10 µmol/l bicuculine reduced [³H]flunitrazepam binding by 40 %).

It can be concluded that carefully designed radioligand assays which can be performed in an academic laboratory are appropriate for screening a small number of drugs, especially if these are potential hits because of their rational design. Therefore, the low throughput rate could be partially balanced by a higher performance when compared to what is done in a robotic high throughput screening where simplification of assay conditions can lead to false negative results.

Zusammenfassung

Radioliganden Bindungs Assays im Arzneistoff Findungsprozeß: Probleme des Hochdurchsatz Screenings

Radioliganden Bindungs Assays, in denen direkt die Fähigkeiteiner Substanz zur Interaktion mit einem spezifischen Molekül untersucht wird, sind Teil des Arzneistoff -Findungsprozesses. Die Notwendigkeit einer hohen Durchsatzrate im Arzneistoff Screening führt zu vereinfachten Testverfahren, die die Wahrscheinlichkeit falscher Negativ-Ergebnisse erhöhen. Besonders problematisch ist das spannungsgesteuerte Ionenkanal-Arzneistoff Findungsverfahren, bei dem die Versuchsplanung große Sorgfalt erfordert, da häufig mehrere (interagierende) Bindungsstellen existieren. Um dies zu veranschaulichen, wurden drei verschiedene Assays, die im universitären Arzneistoff -Findungsprogramm der Autorenverwendet werden, ausgewählt, da hier die Komplexität des Problems sehr deutlich wird: (I) 20 mmol Koffein führten bei 0,3 µmol freiem Kalzium nahezu zu einer Verdoppelung der [³H]Ryanodin Bindung an Rattenherz -Mikrosomen (Erhöhung um 89 % gegenüber den Kontrollen), zeigten jedoch keine Wirkung bei Verwendung einer hohen Konzentration von freiem Kalzium (107 µmol), wie sie meist in Ryanodin-Bindungs- Assays verwendet wird. (II) Ein Agonist desionotropen Glutamat-Rezeptors vom Kainat Typ kann die [³H]Kainat-Bindung unddamit die Erregung von Kleinhirn-Membranen je nach Konzentration ganz unterschiedlich beeinflussen: unmarkierte Kainsäure per se führte zu einer Stimulation von ca. 30 % (bei 50–100 nmol), zeigte keine Wirkung (bei 200 nmol) oder verringerte sogar immer mehr (bei 0,3-2 µmol) die Bindung von 5 nmol [³H] Kainat; dies zeigt deutlich, wie riskant es ist, nur eine einzige Konzentration im Arzneistoff-Screening zu verwenden. (III) In einem klassischen [³H]Flunitrazepam Bindungs Assay wurde die stimulierende Wirkung eines GABA ( γ-Aminobutyrat) Agonisten nur bei Verwendung vongründlichgewa schenen Rattenhirn Synaptosomenbeob achtet (10 µmol GABA erhöhten die Flunitrazepam-Bindung um 90 %). Andererseits wurde die inhibitorische Wirkung eines GABA-Antagonisten nur beiVerwendung von unbehandelten Synaptosomen beobachtet (10 µmol Bicuculin reduzierten die [³H]Flunitrazepam-Bindung um 40 %).

Daraus kann geschlossen werden, dass sorgfältig geplante Radioliganden-Assays, die in einem Universitätslabor durchgeführt werden können, für das Screening einer kleinen Anzahl von Substanzen wegen des rationalen Designs sehr nützlich sind, insbesondere wenn es sich um mögliche Arzneistoff Kandidaten handelt. Somit kann die geringe Durchsatzrate teilweise durch eine höhere Erfolgsquote im Vergleich zum automatisierten Hoch-durchsatz -Screening kompensiert werden, bei dem die Vereinfachung der Ver-suchsbedingungen fälschlicherweise zu negativen Ergebnissen führen kann.

Key words

γ-Aminobutyric acid agonist - Benzodiazepine - Caffeine - Drug Screening - Kainic acid - Radioligand binding - Ryanodine