Durchflusszytometrische Bestimmung von vitalen CD34⁺ hämatopoietischen Stamm-/Vorläuferzellen

Zusammenfassung

Die durchflusszytometrische Bestimmung der Anzahl vitaler CD34⁺ Vorläufer- und Stammzellen ist in vielen Laboratorien zu einer Routineuntersuchung geworden und ihre Genauigkeit ist entscheidend für die Bestimmung der Qualität von stammzellhaltigen Produkten und für die Optimierung des Sammelns von Stammzellen nach Mobilisierung. Allerdings ist die Komplexität der Messung und Analyse noch immer eine der Hauptursachen für fehlerhafte Bestimmungen der Anzahl vitaler CD34⁺ Stammzellen, was zum Misslingen der Stammzelltherapie und zu gravierenden Konsequenzen für den Patienten führen kann. Neben dem Einsatz verschiedener Reagenzien und Protokolle zur Probenlagerung, Probenaufarbeitung und Färbung von vitalen CD34⁺ Stammzellen sind das Verständnis und der korrekte Gebrauch der Gating-Strategie zur Identifizierung von CD34⁺ Stammzellen entsprechend den ISHAGE-Richtlinien für eine verlässliche und reproduzierbare akkurate Bestimmung der Anzahl von vitalen CD34⁺ Stammzellen von zentraler Bedeutung.

Abstract

Flow cytometric enumeration of viable CD34⁺ progenitor and stem cells has become a routine measurement in many laboratories and its accuracy is crucial for the assessment of the quality of stem cell products or to optimize the timing of collection following stem cell mobilization. Yet the complexity of the measurement and analysis is still a source of incorrect determinations of viable CD34⁺ stem cell numbers which may lead to the failure of stem cell therapies and inflict severe clinical consequences for the patients. Besides the use of different reagents and protocols for the sample storage, preparation and the staining of the CD34 antigen expressed on stem cells the comprehension and correct use of the gating strategy for the identification of CD34⁺ stem cells according to the ISHAGE guidelines is essential for a reliable and reproducible accurate enumeration of viable CD34⁺ stem cells.

Schlüsselwörter

CD34-Zellzählung - Durchflusszytometrie - hämatopoetische Rekonstitution - Immunphänotypisierung - Richtlinien der ISHAGE „International Society for Hemotherapy and Graft Engineering (ISHAGE, ISCT)“ - Ein-Plattform - hämatopoetische Stamm-/Vorläuferzelllen - Vitalitätsmessung

Key words

CD34 cell enumeration - flow cytometry - hematopoietic reconstitution - immune phenotyping - ISHAGE-Guideline (International Society for Hemotherapy and Graft Engineering [ISHAGE, ISCT]) - single platform - hematopoietic stem-/progenitor cells - viability measurement

• Literatur

• 1 Barnett D et al. Absolute CD4+ T-lymphocyte and CD34+ stem cell counts by single-platform flow cytometry: the way forward. Brit J Haematol 1999; 106: 1059-1062
• 2 Gratama JW et al. Enumeration of Immunologically Defined Cell Populations by Flow Cytometry. Clinical and Laboratory Standards Institute Approved Guideline. 2nd. ed. 2007. 27. 26-28
• 3 Antonenas V et al. Fresh PBSC harvests, but not BM, show temperature-related loss of CD34 viability during storage and transport. Cytotherapy 2006; 8: 158-165
• 4 Keeney M et al. Single platform enumeration of viable CD34(pos) cells. J Biol Regul Homeostatic Agents 2003; 17: 247-253
• 5 Brecher ME et al. North American multicenter study on flow cytometric enumeration of CD34+ hematopoietic stem cells. J Hematother 1996; 5: 227-236
• 6 Bossuyt X, Marti GE, Fleisher TA. Comparative analysis of whole blood lysis methods for flow cytometry. Cytometry 1997; 30: 124-133
• 7 Macey MG et al. How should CD34+ cells be analysed? A study of three classes of antibody and five leucocyte preparation procedures. J Immunol Methods 1997; 204: 175-188
• 8 Europäisches Direktorat für die Qualität von Arzneimitteln. Zählung der CD34/CD45+-Zellen in hämatopoietischen Produkten. Europäische Pharmakopöe (7. Ausg). Stuttgart: Deutscher Apotheker Verlag; 2011: 325-326
• 9 Sutherland DR et al. The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry. International Society of Hematotherapy and Graft Engineering. J Hematother 1996; 5: 213-226
• 10 Dauber K et al. Enumeration of viable CD34(+) cells by flow cytometry in blood, bone marrow and cord blood: results of a study of the novel BD stem cell enumeration kit. Cytotherapy 2011; 13: 449-458
• 11 Chang A, Ma DD. The influence of flow cytometric gating strategy on the standardization of CD34+ cell quantitation: an Australian multicenter study. Australasian BMT Scientists Study Group. J Hematother 1996; 5: 605-616
• 12 Keeney M et al. Single platform flow cytometric absolute CD34+ cell counts based on the ISHAGE guidelines. International Society of Hematotherapy and Graft Engineering. Cytometry 1998; 34: 61-70
• 13 Borowitz MJ et al. Immunophenotyping of acute leukemia by flow cytometric analysis. Use of CD45 and right-angle light scatter to gate on leukemic blasts in three-color analysis. Am J Clinl Pathol 1993; 100: 534-540
• 14 Whitby A et al. ISHAGE protocol: are we doing it correctly? Part B: Clinical cytometry. Cytometry 2012; 82: 9-17
• 15 Gratama JW et al. Flow cytometric enumeration of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells. European Working Group on Clinical Cell Analysis. Cytometry 1998; 34: 128-142
• 16 Zweites Gesetz zur Änderung arzneimittelrechtlicher und anderer Vorschriften. Bundesrat Drucksache 91/12 vom 30.03.2012
• 17 „Arzneimittel- und Wirkstoffherstellungsverordnung vom 3. November 2006 (BGBl. I S. 2523), die zuletzt durch Artikel 2 Absatz 11 des Gesetzes vom 22. Dezember 2011 (BGBl. I S. 3044) geändert worden ist“.
• 18 Barnett D et al. Guideline for the flow cytometric enumeration of CD34+ haematopoietic stem cells. Prepared by the CD34+ haematopoietic stem cell working party. General Haematology Task Force of the British Committee for Standards in Haematology. Clin Laboratory Haemat 1999; 21: 301-308
• 19 Keeney M et al. Isotype controls in the analysis of lymphocytes and CD34+ stem and progenitor cells by flow cytometry–time to let go!. Cytometry 1998; 34: 280-283