Hydrophobe Gallensäuren schädigen primäre humane Hepatozyten durch einen Caspase-unabhängigen Mechanismus

Einleitung: Hydrophobe Gallensäuren können Hepatozyten schädigen. Ob es sich bei diesem Zelluntergang um reine Apoptose oder Nekrose handelt oder ob sogar eine in den letzten Jahren neu definierte Form des Zelltodes, die sogenannte „Nekroptose“ vorliegt, ist unklar. Die meisten existierenden Daten zum Gallensäuren-induzierten Zelltod beruhen entweder auf Hepatomzelllinien oder Hepatozyten von Maus oder Ratte. Daher war das Ziel dieser Arbeit, den Mechanismus zu identifizieren, durch den Glycochenodeoxycholsäure (GCDCA) menschliche Hepatozyten schädigt.

Methoden: Primäre humane Hepatozyten wurden von der „Human tissue und cell research foundation“ (Regensburg) und von Invitrogen bezogen. Die Zellen wurden mit GCDCA und/oder Tauroursodeoxycholsäure (TUDCA; 100µm, 200µm, 500µm) inkubiert. TNFα+Actinomycin D (28µg/l) und anti-Apo-1 (500ng/ml) dienten als Positivkontrolle. Apoptose wurde mittels Caspase-3/7-Assay quantifiziert, der Zellschaden mittels LDH-Gehalt im Medium und einem WST-Assay. Um festzustellen, ob Nekroptose in Hepatozyten vorkommt, wurden primäre Rattenhepatozyten mit TNFα+Actinomycin D (28µg/l), dem Pancaspase-Inhibitor zVED (0,5µmol/l) alleine, sowie in Kombination mit dem RIP-1Inhibitor Necrostatin (100µmol/l), inkubiert.

Ergebnisse: GCDCA löste in menschlichen Hepatozyten keinen signifikanten Anstieg der Caspase3/7-Aktivität aus. Jedoch zeigte sich ein durch GCDCA (100µm, 200µm, 500µm) gesteigerter LDH-Gehalt auf das 24-, 32- bzw. 49-fache. Durch eine Konzentration von 500µm konnte die metabolische Aktivität signifikant von 100% auf 43% gesenkt werden. TNFα+Actinomycin D führten bei primären Rattenhepatozyten zu einem 193-fach höherem LDH-Gehalt im Medium, der sich nur durch Necrostatin-1 in Kombination mit zVED auf Kontrollniveau zurückführen ließ.

Diskussion: Die durch GCDCA ausgelösten Zellschäden in humanen Hepatozyten waren in allen verwendeten Konzentrationen Caspase-unabhängig. Sowohl die erhöhte LDH Konzentration im Medium als auch die Verringerung der metabolischen Aktivität sprechen entweder für einen nekrotischen, oder einen zusätzlichen, Caspase-unabhängigen Prozess. Da Nekroptose in primären Rattenhepatozyten vorhanden ist, könnte dieser Mechanismus auch bei humanen Hepatozyten zur Schädigung durch Gallensäuren beitragen.