Identifikation von neuen BRAF-Splicevarianten im kolorektalen Karzinom

Einleitung: In kolorektalen Karzinomzellen wurde eine C-terminal verkürzte Proteinvariante der B-Raf Kinase entdeckt (Seth et al., 2009). Die Autoren vermuten, dass die alternative Isoform nur von Wildtyp-Allelen gebildet wird, und dass sie keine Kinaseaktivität aufweist. Beide Hypothesen wurden nicht experimentell untersucht.

Ziele: C-terminal verkürzte B-Raf Proteinisoformen sollten hinsichtlich ihrer Kinaseaktivität charakterisiert werden. Das alternative Splicing dieser Isoformen sollte quantifiziert und ihr Ursprungsallel aufgeklärt werden.

Methodik: BRAF-Transkripte aus kolorektalen Karzinomzellen wurden in cDNA umgeschrieben, kloniert und sequenziert. Nach der Expression der Isoformen in HEK293-Zellen wurde die Phosphorylierung des Substrates Mek 1/2 im Western-Blot untersucht.

Ergebnis: Neben der bereits beschriebenen Variante wurden drei weitere C-terminal verkürzte BRAF-Splicingvarianten gefunden. Keine der alternativen Isoformen zeigte Kinaseaktivität. Der Anteil alternativer Transkripte wurde bestimmt und lag in RKO-Zellen bei insgesamt 9%. In RKO wurde eine neue Punktmutation auf genetischer Ebene entdeckt, die eine Zuordnung der deletierten Transkripte zu ihrem Ursprungsallel ermöglichte. Es konnte gezeigt werden, dass C-terminal deletiertes B-Raf entgegen der urprünglichen Annahme sowohl von Wildtyp-, als auch von V600E-kodierenden Allelen gebildet wird.

Tab.1: Charakterisierung der B-Raf Isoformen

mRNA-Splicing	Translationsende	Molekulargewicht	Kinaseaktivität
Konsensus (Wildtyp-Sequenz)	Exon 18	84 kDa	100%
Konsensus (V600E-mutiert)	Exon 18	84 kDa	˜300%
Variante 1 (Exon 14/15 deletiert)	Exon 16	65 kDa	<1%
Variante 2 (Exon 15a eingefügt)	Exon 15a	69 kDa	<1%
Variante 3 (Exon 16a eingefügt)	Exon 17	73 kDa	<1%
Variante 4 (Exon 16b eingefügt)	Exon 16b	74 kDa	<1%

Schlussfolgerung: Durch die Identifikation der Splicing-Varianten in RKO-Zellen, die in der Erstpublikation als negativ beschrieben wurden, konnte gezeigt werden, dass die hier verwendete Methode deutlich sensitiver ist als die Analyse differentieller Schmelzkurven. Kolorektale Karzinomzellen zeigen einen hohen Anteil von Transkripten für Kinase-inaktives B-Raf Protein. Hierin könnte ein Mechanismus zur Regulation des MAPK-Signalweges liegen. Das Splicing alternativer B-Raf Isoformen in kolorektalen Zellen ist unabhängig vom V600E-Mutationsstatus.