Geburtshilfe Frauenheilkd 2014; 74 - PO_Onko02_17
DOI: 10.1055/s-0034-1388362

Etablierung der Next Generation Sequenziertechnologie (NGS) in der genetischen Prädispositionsdiagnostik des hereditären Mamma- und Ovarialkarzinoms

L Rath 1, E Honisch 1, T Fehm 2, D Niederacher 1
  • 1Universitätsklinik Düsseldorf, Frauenklinik, Forschungslabor Frauenklinik, Düsseldorf, Germany
  • 2Universitätsklinik Düsseldorf, Frauenklinik, Düsseldorf, Germany

Fragestellung: Aufgrund hoher Kosten und limitiertem Durchsatz aktuell eingesetzter Technologien bleibt die Prädispositionsdiagnostik hereditärer Mamma- und Ovarialkarzinome (HBOC) trotz Identifizierung zusätzlicher relevanter Gene derzeit weitgehend auf die Gene BRCA1/2, RAD51C, CHEK2 in Familien mit stringenten Einschlusskriterien beschränkt.

NGS erlaubt die parallele Sequenzierung mehrerer Millionen DNA-Templates bei deutlicher Zeit- und Kostenreduktion und ermöglicht die Analyse eines erweiterten Multi-Gen-Panels. Mittels NGS-basierter BRCA1/2-Mutationsdetektion versuchen wir eine Evaluierung der Technologie hinsichtlich einer Implementierung in der Prädispositonsdiagnostik.

Methodik: HBOC-Patienten werden mittels Multiplex-PCR von BRCA1/2 (BRCA MASTRTM Dx-Assay, Multiplicom) und Pooling patientenspezifisch indexierter Amplikons auf dem MiSeq-System (Illumina) mittels Paired-end Sequenzierung prospektiv analysiert. Die bioinformatische Auswertung erfolgt durch Sophia Genetics. Detektierte pathogene Mutationen werden per Sanger-Sequenzierung verifiziert.

Ergebnis: Patientenspezifisch generierte FASTQ-Dateien wurden bei Sophia Genetics hochgeladen. Deren bioinformatische Analyse umfasst die Erstellung eines Qualitäts- und Variantenreports mit HGVS-Nomenklatur, Prädiktion funktioneller Signifikanzen und Datenbank-Abgleich der Mutationen sowie Daten-Speicherung.

Aktuell wurden 24 Patienten untersucht, wobei bis zu 16 Patienten pro Lauf innerhalb einer Woche parallel analysiert werden konnten. Vier klar pathogene Varianten wurden detektiert und verifiziert. Q-Scores größer 30 in über 90% der Reads demonstrieren eine hohe Qualität der Sequenzierergebnisse. Die mittlere Read-Anzahl pro Probe lag bei rund 1150000 mit einer Mapping-Rate von über 95%. Die mittlere Sequenziertiefe betrug 8606x. Die angestrebte Mindestsequenziertiefe von 100x konnte in > 99% der Amplicons erreicht werden.

Schlussfolgerung: NGS ermöglicht eine schnelle und akkurate Detektion von BRCA1/2-Keimbahnmutationen und qualifiziert diese Technologie für die Analyse erweiterter Gen-Sets im Rahmen der genetischen Prädispositionsdiagnostik bei HBOC.