Untersuchungen zur Freisetzung extrazellulärer DNA und miRNA durch in-vitro kultivierte Zellen

Einleitung: Die molekulare Charakterisierung zellfreier Nukleinsäuren erlangt eine immer größere Bedeutung. Dennoch sind die Mechanismen der Freisetzung von DNA und RNA bisher nur unvollständig bekannt. Im Allgemeinen wird davon ausgegangen, daß der größte Teil der im Plasma und anderen Körperflüssigkeiten detektierbaren Nukleinsäuren durch Apoptose und Nekrose von Zellen freigesetzt wird. Untersuchungen an in-vitro kultivierten humanen Lymphozyten zeigten aber auch, daß diese aktiv DNA freisetzen können, ohne daß die Zellen zu Grunde gehen. Ziel der durchgeführten Experimente ist es ein tieferes Verständnis der Freisetzung von extrazellulären Nukleinsäuren zu bekommen.

Material und Methoden: Humane Lungenzellinien (Tumor und Normal) wurden in-vitro kultiviert und zu definierten Zeitpunkten die Menge an freigesetzter DNA und miRNA im Zellkulturüberstand mittels real-time PCR gemessen. Parallel erfolgte gleichzeitig eine Zellzählung.

Ergebnisse: Während sich die Zellzahl in 24 h um den Faktor 2 – 7 erhöht, steigt die Menge an freigesetzter DNA 10- bis 100-fach an. Diese Menge bleibt bis zu Tag 3 der Kultivierung konstant. Im Gegensatz dazu bleibt die Menge an ausgeschütteter miRNA (U6, miR-1285, miR-650, miR-1303) in den ersten 24h nahezu konstant und steigt in den Tagen 1 bis 3 um den Faktor 10 bis 10.000 an wobei von den untersuchten miRNAs unterschiedliche Mengen produziert werden. Im Vergleich dazu bleibt die intrazelluläre miRNA Quantität nahezu gleich.

Diskussion: Diese Ergebnisse legen nahe, daß i) in-vitro kultivierte normale und Tumorzellen der Lunge Nukleinsäuren aktiv freisetzen können, ohne daß sie dabei zugrunde gehen und ii) die Freisetzungsmechanismen für DNA und miRNA zu unterschiedlichen Zeiten aktiv sind. Durch die Hemmung spezifischer Transportwege soll geklärt werden in welchem Maß die Freisetzung von DNA und miRNA betroffen sind.