Untersuchungen zur Beeinflussung von Estradiol auf den Methylierungsstatus des ER Alpha Promotors in SAOS-2 Zellen in vitro als Modell zur Evaluation osteoporotischer Prozesse

J Tübel; C Marthen; L Kuntz; I Wiest; C Alexiou; U Jeschke; R Burgkart

doi:10.1055/s-0035-1555031

Geburtshilfe und Frauenheilkunde, Table of Contents

Untersuchungen zur Beeinflussung von Estradiol auf den Methylierungsstatus des ER Alpha Promotors in SAOS-2 Zellen in vitro als Modell zur Evaluation osteoporotischer Prozesse

J Tübel ¹, C Marthen ¹, L Kuntz ¹, I Wiest ², C Alexiou ³, U Jeschke ², R Burgkart ¹

¹Klinikum rechts der Isar der TU München; Klinik für Orthopädie und Sportorthopädie, Experimentelle Forschung, München, Deutschland
²Klinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe der LMU; Campus Innenstadt, München, Deutschland
³Hals-Nasen-Ohren-Klinik, Universitätsklinikum Erlangen; Sektion für Experimentelle Onkologie und Nanomedizin, Erlangen, Deutschland

Abstract

Einleitung/Zielsetzung:

Die Bedeutung des Steroidhormons Estradiol (E2) auf den Knochenstoffwechsel ist bekannt. Durch Bindung des Liganden Estradiol (E2) an den Estrogenrezeptor α (ERα) wird dieser aktiviert, bindet an das „estrogen response element“ (ERE) und steuert die Genexpression. Durch epigenetische Prozesse, wie z.B. die Methylierung der „cytosine-phosphatidyl-guanine (CpG) islands“ kann die Transkription von Zielgenen verändert werden. Bisher gibt es wenig Informationen, ob beim Knochenumbau Methylierungsprozesse des ER eine Rolle spielen. Ziel dieser Pilotstudie war, nach Stimulierung mit E2 den Methylierungssatus von ERα in SAOS-2 Zellen zu untersuchen.

Material & Methoden:

SAOS-2 Zellen wurden in DMEM kultiviert und mit 10 nmol E2 für 24h inkubiert. Unstimulierte Zellen dienten als Kontrolle. Mittels Immunhistochemie (IHC) wurde die Expression von ERα analysiert. Die Auswertung erfolgte über den Immunreaktiven Score. Zur Ermittlung der mRNA Genexpression wurde die RNA extrahiert und eine qPCR durchgeführt. Die unstimulierten Zellen dienten als Referenzkontrolle. Die Semiquantifizierung der ERα mRNA erfolgte mithilfe der 2^-ΔΔct Methode. Zum Nachweis der Methylierung des ERα Promotors wurde je 1 µg extrahierte genomische DNA mit Bisulfit behandelt und eine real-time methylation-specific PCR (rt-MSP) durchgeführt.

Ergebnisse:

Histologisch zeigten die SAOS-2 Zellen nach E2 Stimulation einen deutlichen Anstieg der Expression des ERα. Die 7-fache Erhöhung des mRNA Levels in der rt-PCR bestätigt die Ergebnisse der IHC bei den stimulierten Zellen. Eine Methylierung des ERα Promotors konnte bei den stimulierten Zellen nicht gemessen werden, während bei den unstimulierten Zellen die Methylierung des ERα Promotors nachzuweisen war.

Zusammenfassung:

Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass mit einer E2 Stimulierung auch die Methylierung des ERα Promotors beeinflusst werden kann. Die Regulation der ERα Synthese scheint über die epigenetischen Veränderungen der genomischen DNA möglich zu sein. Die Ergebnisse dieser Pilotstudie zeigen, dass SAOS-2 Zellen ein interessantes Modell zur Untersuchung der ERα Regulation beim Knochenumbau darstellen.