miRNAs und immunmodulatorische Ectonucleotidasen als mögliche Ansatzpunkte für die Diagnostik und Immuntherapie von Ovarialkarzinomen

Hintergrund:

Da es noch keine zuverlässige Methode zur Frühdiagnostik von Eierstockkrebs gibt, profitieren nur wenige Patientinnen von der guten Behandelbarkeit lokal begrenzter Karzinome. Aktuell sind daher 5 Jahre nach Diagnosestellung weniger als 20 – 40% aller Ovarialkarzinompatientinnen noch am Leben. Immunantworten könnten aber einen bedeutenden Beitrag zur Diagnostik und Behandlung dieser Erkrankung leisten. So könnte die tumorbedingte systemische Beeinflussung des Immunsystems die Voraussetzungen für einen minimalinvasiven diagnostischen Ansatz mittels miRNA-profiling liefern. Außerdem könnten spätere Therapieschemata durch das begleitende Targeting der adenosinproduzierenden Ectonukleotidasen CD39 und CD73 immunologisch optimiert werden.

Methodik:

Untersucht wurden die Ovarialkarzinom (OvCA)-Zelllinien SKOV3 und OAW42, aus OvCA-Cokulturen gewonnene Tumor-assoziierte Makrophagen (TAM), OvCA-Gewebeproben, Ascites-OvCA-Zellisolate, TAMs aus Ascites und Leukozyten gesunder Spender. Expressionsanalysen von CD39 und CD73 erfolgten mittels Durchflusszytometrie, RT-PCR, Immunoblotting und Immunhistochemie. OvCA Zellen wurden entweder bestrahlt (3 Gy), oder mit 15µM Doxorubicin bzw. 20µM Cisplatin behandelt. Durch die small molecules ARL67156, APCP (oder spezifische Antikörper) sowie SCH58261 wurden CD39, CD73 oder ADORA2a blockiert. Mithilfe eines Reportergen-Assay wurde Adenosin quantifiziert. Dessen immunmodulatorische Wirkung wurde über CFSE-basierte CD4 T Zell-Proliferationsassays, recall to antigen-Assays, modifizierte 4h-FATAL-Assays und Migrationsassays bestätigt. Zur Evaluierung von miRNA-Profilen als diagostischen Markern wurde RNA aus Vollblutproben von OvCAPatientinnen und anderweitig erkrankten sowie gesunden Kontrollen isoliert. Über microarrays wurde die Expression von ca. 900 miRNAs überprüft und mit biostatistischen Methoden wie support vector machines und student's t test analysiert.

Ergebnisse:

OvCA-Zelllinien und ex situ-OvCA-Isolate exprimieren in erheblichem Ausmaß CD39 und CD73. Dies kann durch Behandlung mit Bestrahlung, Doxorubicin und Cisplatin noch verstärkt werden. In vitro kann hierüber biologisch aktives Adenosin generiert werden, welches CD4 und CD8 T Zellen sowie NK-Zellen gesunder Spender supprimiert. TAMs im OvCA exprimieren ebenfalls CD39 und CD73. In vitro kann diese Expression auch durch Kokultivierung von Makrophagen mit OvCA-Zellen induziert werden. In vivo wurden im Vollblut von OvCA-Patientinnen spezifisch deregulierte miRNA-Profile nachgewiesen. Diese erlauben bei Beschränkung auf serös-papilläre Formen eine Diagnosestellung mit annähernd 90% Sensitivität und Spezifität bei guter Abgrenzung gegenüber anderen Erkrankungen.

Diskussion und Ausblick:

Über das lokale Immunphänomen der Adenosingenerierung über CD39 und CD73 scheint beim OvCA eine spezifische immunologische Adjuvanz von bereits existierenden Therapiestrategien möglich. Diese Hypothese soll zeitnah in vivo verifiziert werden. Die systemische Beeinflussung der vor allem aus zirkulierenden Immunzellen stammenden miRNA-Profile wird derzeit prospektiv validiert und hinsichtlich der möglichen Verwendung als diagnostisches Hilfsmittel evaluiert.