Das Frakturhämatom: Simulation der initialen Phase der Frakturheilung in vitro

Einleitung:

Die initiale Phase der Frakturheilung ist besonders anfällig für negative Einflüsse wie z.B. Medikamente oder Komorbiditäten. Patienten mit Dysfunktionen in Bezug auf ihre Frakturheilungskapazität leiden unter starken Schmerzen, eingeschränkter Mobilität und eingeschränkter Lebensqualität. Die erste Phase der Frakturheilung ist u.a. gekennzeichnet durch die Bildung eines Frakturhämatoms und durch eine sauerstoffarme Mikroumgebung. Um neue therapeutische Strategien zu testen, haben wir ein in vitro Frakturhämatom-Modell (FHs) entwickelt, das vollständig aus humanem Material besteht. Dieses Modell bietet uns die Möglichkeit, effektiv Tiere im Versuch einzusparen und – sehr ähnlich der menschlichen in vivo Situation – wichtige Prozesse der initialen Phase der Frakturheilung zu simulieren.

Methode:

Zur Herstellung der FHs wurden humanes peripheres Blut und humane mesenchymale Stromazellen (MSCs) in definierter Konzentration und Zelldichte vermischt und anschließend koaguliert. Danach wurden die FHs in osteogenem Medium für bis zu 48 Stunden unter Hypoxie (37 °C, 5% CO2, 1% O2) sowie als Kontrolle unter Normoxie (37 °C, 5% CO2, 18% O2) inkubiert. Nach verschiedenen Inkubationszeiten (6, 12, 24 und 48h) wurden die FHs aufbereitet und die Zellzusammensetzung (Durchflusszytometrie), die mRNA-Expression relevanter Gene (qRT-PCR) und die Sekretion entscheidender Zytokine/Chemokine (Multiplex) analysiert.

Ergebnisse:

Nach 48h Inkubation unter hypoxischen Bedingungen stellen die MSCs den überwiegenden Zellanteil innerhalb des in vitro FHs, während der Anteil der Leukozyten mit der Zeit kontinuierlich abnimmt. Im FH stieg die mRNA-Expression der osteogener Marker RUNX2 und SPP1 nach 48h signifikant an. Ebenfalls auf Genexpressionsebene hochreguliert zeigten sich die Entzündungsmarker IL6 und IL8 sowie die Marker MMP2 und MMP9, die für Proteine codieren welche die Matrix von Zellen auflösen und so eine Migration von Zellen ermöglichen. Unter hypoxischen Bedingungen wurden auch die für die Anpassung an Hypoxie verantwortlichen Marker HIF1, LDHA und VEGF nach 48h auf Genexpressionsebene hochreguliert. Weiterhin haben wir die induzierte Sekretion relevanter inflammatorischer Zytokine bzw. Chemokine (IL6, IL8, MCP-1 und MIP) in den Überständen nachgewiesen. Die gewonnenen Daten zeigen sehr gute Übereinstimmungen mit ex vivo Daten von humanen Frakturhämatomen.

Diskussion:

In unserem Frakturhämatom-Modell konnten wir somit wichtige Prozesse der initialen Phase der Frakturheilung darstellen, Parallelen zu ex vivo Daten von humanen Frakturhämatomen finden und vielversprechende Ergebnisse liefern. Dies ermöglicht es uns, unser System für präklinische Tests therapeutischer Ansätze zu nutzen, die den natürlichen Regenerationsprozess potenziell unterstützen, indem sie die Frakturheilung angemessen einleiten.