Präimplantationsdiagnostik zum Ausschluss von Shwachman-Bodian-Diamond-Syndrom: Etablierung eines Allel-spezifischen Multiplex-PCR basierten Assays für das SBDS-Gen

Zielsetzung Das Shwachman-Bodian-Diamond-Syndrom (SBDS) ist eine seltene autosomal-rezessive Blutbildungstörung und nach der Mukoviszidose zweihäufigste Ursache für eine exokrine Pankreasinsuffizienz bei Kindern. Die Erkrankung wird durch pathogene Varianten im SBDS-Gen (7q11.21) verursacht. In dreiviertel der Fälle entstehen diese Varianten durch Genkonversion mit dem Pseudogen SBDSP1, einer zu 97% identischen, nicht funktionellen Kopie des SBDS-Gens. Unser Ziel war es, eine robuste SBDS-spezifische Präimplantationsdiagnostik (PGT) zu etablieren.

Materialien Die Mutter der Indexpatientin ist Anlageträgerin der Klasse-5-Variante SBDS:NM_016038.4:c.183_184delinsCT (Klasse 5) und bei dem Vater liegt die Klasse-5-Variante SBDS:NM_016038.4:c.258+2T>C in heterozygoter Form vor. Das familienspezifische System wurde an gDNA von 7 Familienmitgliedern und mehr als 40 Einzelzellen des Paares getestet.

Methoden Zur indirekten Diagnostik wurden 30 STR-Marker in der Nachbarschaft des SBDS-Gens und SBDSP1 genotypisiert. Für den direkten Nachweis wurden zwei Strategien verglichen: gezielte Amplifikation des SBDS-Gens (A: Amplikonlänge 458 bp) und parallele Amplifikation von SBDS und SBDSP1 (B: Amplikonlänge: 286 bp) gefolgt von Allel-spezifischer PCR und Minisequenzierung.

Ergebnisse Für die indirekte Diagnostik wurden 14 STR-Marker, dabei auch bisher nicht publizierte Marker, ausgewählt. Aufgrund deutlich niedrigeren ADO-Raten und Amplifikationsversagen wurde für den direkten Nachweis Strategie B verfolgt. Pro Variante wurden 3-4 SNAP-Primer getestet und jeweils der Primer mit höchster Spezifität selektiert. Der Assay erfüllt alle ESHRE Akzeptanzkriterien.

Zusammenfassung Unser Allel-spezifisches PGT-System erlaubt zuverlässige Amplifikation von Varianten im SBDS-Gen und deren Unterscheidung von SBDSP1-Varianten. Zusätzliche Sicherheit und Detektion von Rekombinationsereignissen wird durch parallele Analyse benachbarter STR-Marker gewährleistet. Die Effizienz von Multiplex-PCR an Einzelzellen ist von der Amplikonlänge abhängig. Das Paar befindet sich zurzeit in reproduktionsmedizinischer Behandlung.

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Article published online:
11 October 2022