In-silico- und In-vitro-Identifizierung von pan-coronaviralen Hauptprotease-Inhibitoren aus einer großen Naturstoffbibliothek

Die Hauptprotease (Mpro oder 3CLpro) in Coronaviren stellt ein vielversprechendes spezifisches Arzneimittelziel dar, da sie für die Spaltung des Viruspolypeptids unerlässlich ist und über eine einzigartige Spaltstelle verfügt, die in menschlichen Wirtsproteasen nicht vorhanden ist [1]. In dieser Studie untersuchten wir potenzielle natürliche Pan-Coronavirus-Medikamente mithilfe von In-vitro- und In-silico-Ansätzen und drei Coronavirus-Hauptproteasen als Behandlungsziele ([Abb. 1]).

Abb. 1  Potenzielle Kandidaten.

Mit dem PyRx-Programm wurden 39.442 naturproduktähnliche Verbindungen aus der ZINC-Datenbank und 121 vorausgewählte Phytochemikalien aus Heilpflanzen mit bekannter antiviraler Aktivität gescreent. Nach einer Bewertung mit der Lipinski'schen Fünferregel wurde für die 33 besten Verbindungen beider Bibliotheken ein molekulares Docking durchgeführt. Für die Spitzenkandidaten aus beiden In-silico-Ansätzen wurden enzymatische Assays durchgeführt, um ihre Fähigkeit zur Hemmung von SARS-CoV-2 Mpro zu testen. Die vier Verbindungen (Hypericin, Rosmarinsäure, Isorhamnetin und Luteolin), die SARS-CoV-2 Mpro in vitro am effizientesten hemmten, wurden weiter auf ihre Wirksamkeit bei der Hemmung von Mpro von SARS-CoV-1 und MERS-CoV getestet. Zur Validierung der Bindung dieser Wirkstoffe an rekombinante Mpro-Proteine von SARS-CoV-2, SARS-CoV-1 und MERS-CoV wurde eine mikroskalige Thermophorese zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten (Kd) durchgeführt. Die Zytotoxizität von Hypericin, Rosmarinsäure, Isorhamnetin und Luteolin wurde in menschlichen diploiden MRC-5-Lungenfibroblasten mithilfe des Resazurin-Zellviabilitätstests untersucht, um ihre therapeutischen Indizes zu bestimmen. Der Sequenzabgleich von Mpro von SARS-CoV-2 ergab eine Ähnlichkeit von 96,08%, 50,83%, 49,17%, 48,51%, 44,04% und 41,06% mit Mpro anderer humanpathogener Coronaviren (SARS-CoV-1, MERS-CoV, HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-HKU1 bzw. HCoV-229E). Molekulares Docking zeigte, dass 12 der 121 Verbindungen an SARS-CoV-2 Mpro an der gleichen Bindungsstelle wie der Kontrollinhibitor GC376 gebunden wurden. Enzyminhibitionstests zeigten, dass Hypericin, Rosmarinsäure, Isorhamnetin und Luteolin Mpro von SARS-CoV-2 hemmten, während Hypericin und Isorhamnetin Mpro von SARS-CoV-1 hemmten; Hypericin zeigte hemmende Wirkungen auf Mpro von MERS-CoV. Die mikroskalige Thermophorese bestätigte die Bindung dieser Verbindungen an Mpro mit hoher Affinität. Resazurin-Tests zeigten, dass Rosmarinsäure und Luteolin für MRC-5-Zellen nicht zytotoxisch waren, während Hypericin und Isorhamnetin leicht zytotoxisch wirkten. Wir konnten zeigen, dass Hypericin ein potenzielles neues pan-anti-coronavirales Mittel ist, da es an Mpro verschiedener humanpathogener Coronaviren bindet und diese hemmt. Darüber hinaus zeigte Isorhamnetin hemmende Wirkungen auf SARS-CoV-2 und SARS-CoV-1 Mpro, was darauf hindeutet, dass diese Verbindung ein gewisses pan-coronavirales Potenzial haben könnte. Luteolin hatte hemmende Wirkungen gegen SARS-CoV-2 Mpro.

Publikationsverlauf

Artikel online veröffentlicht:
14. Juni 2023

• Literatur

• 1 Hilgenfeld R.. FEBS J 2014; 281: 4085-4096