Zusammenfassung.
Im letzten Jahrzehnt haben molekularbiologische Methoden entscheidend zu einer verbesserten Diagnostik von Infektionserregern beigetragen. Mit der schnell expandierenden Entwicklung von Techniken der Nukleinsäure-Amplifikation, insbesondere ihrer Schlüsseltechnologie der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), wurden dem mikrobiologisch-diagnostischen Labor extrem sensitive und hochspezifische Werkzeuge gegeben, die unabhängig von der Kultivierbarkeit eines Erregers einsetzbar sind. Mit einer Reihe von technischen Entwicklungen und Modifizierungen der ursprünglichen PCR-Technik sowie durch die Generierung alternativer Methoden zur in vitro-Amplifikation konnte der Nachweis von Targetsequenzen von DNA- auf RNA-Moleküle erweitert, eine Quantifizierung der Targetmoleküle erzielt sowie generell erst die Praktikabilität für eine mögliche, routinemäßige Etablierung in der mikrobiologischen Diagnostik erreicht werden. Trotz vielfach erfolgreichem Einsatz steht für viele Anwendungsgebiete eine gründliche, durch Studien abgesicherte labortechnische und klinische Evaluierung und Standardisierung der Nukleinsäure-Amplifikationstechniken noch aus. Im Artikel wird ein Überblick über die aktuellen Entwicklungen der molekularen Diagnostik in der medizinischen Mikrobiologie gegeben, wobei ein besonderes Augenmerk auf die Grenzen und Fehlerquellen der Methoden sowie auf Konsequenzen für die Interpretation von PCR-Ergebnissen gelegt werden soll.
In the recent decade, molecular tests have provided tools for highly sensitive and specific, culture-independent detection of infectious agents in clinical specimens. The rapid development of new methods and among these mainly the prototype method polymerase chain reaction (PCR) result in improved diagnostic procedures. Since its original description, a lot of modifications and advancements of PCR and alternative systems for in vitro amplification of nucleic acids have been developed to meet various requirements for improved detection of both DNA and RNA, quantification of the target molecules, and transfer from basic clinical research into a routine technique for clinical laboratory diagnosis. Since the purposes for which nucleic acid amplification methods should be used in the diagnosis of infectious diseases are often still uncertain, an evaluation and careful examination of the criteria for correct application of these techniques is needed. This review focuses on the recent developments in amplification procedures as well as on the use of these methods in the laboratory diagnosis of infectious diseases. The methodological limitations, future needs and perspectives are addressed.
Schlüsselwörter:
Nukleinsäure-Nachweistechniken - PCR - Hybridisierung - Mikrobiologische Diagnostik
Key words:
Nucleic acid amplification - PCR - Nucleic acid hybridization - Diagnostic microbiology
Literatur
-
1
Mullis K B, Faloona F A.
Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction.
Methods Enzymol..
1987;
155
335-350
-
2
Saiki R K, Scharf S, Faloona F, Mullis K B, Horn G T, Erlich H A, Arnheim N.
Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.
Science.
1985;
230
1350-1354
-
3
Guyer R L, Koshland D E Jr.
The Molecule of the Year.
Science.
1989;
246
1543-1546
-
4
Böttger E C.
Rapid determination of bacterial ribosomal RNA sequences by direct sequencing of enzymatically amplified DNA.
FEMS Microbiol.Lett..
1989;
53
171-176
-
5
Rogall T, Flohr T, Böttger E C.
Differentiation of Mycobacterium species by direct sequencing of amplified DNA.
J. Gen. Microbiol..
1990;
136
1915-1920
-
6
Chee M, Yang R, Hubbell E, Berno E, Huang X C, Stern D, Winkler J, Lockhart D J, Morris M S, Fodor S P.
Accessing genetic information with high-density DNA arrays.
Science..
1996;
274
610-614
-
7
Troesch A, Nguyen H, Miyada C G, Desvarenne S, Gingeras T R, Kaplan P M, Cros P, Mabilat C.
Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays.
J. Clin. Microbiol..
1999;
37
49-55
-
8
Becker K, Roth R, Peters G.
Rapid and specific detection of toxigenic Staphylococcus aureus: use of two multiplex PCR enzyme immunoassays for amplification and hybridization of staphylococcal enterotoxin genes, exfoliative toxin genes, and toxic shock syndrome toxin 1 gene.
J. Clin. Microbiol..
1998;
36
2548-2553
-
9
Hofmann H.
Genotypes and virus load in patients with hepatitis C infection.
Infection.
1995;
423
133-138
-
10
Tetali S, Abrams E, Bakshi S, Paul M, Oyaizu N, Pahwa S.
Virus load as a marker of disease progression in HIV-infected children.
AIDS Res. Hum. Retroviruses.
1996;
12
669-675
-
11
Kirschner P, Rosenau J, Springer B, Teschner K, Feldmann K, Böttger E C.
Diagnosis of mycobacterial infections by nucleic acid amplification: 18-month prospective study.
J. Clin. Microbiol..
1996;
34
304-312
-
12
Bergeron M G, Ouellette M.
Preventing antibiotic resistance through rapid genotypic identification of bacteria and of their antibiotic resistance genes in the clinical microbiology laboratory.
J. Clin. Microbiol..
1998;
36
2169-2172
-
13
Unal S, Hoskins J, Flokowitsch J E, Wu C Y, Preston D D, Skatrud P L.
Detection of methicillin-resistant staphylococci by using the polymerase chain reaction.
J. Clin. Microbiol..
1992;
30
1685-1691
-
14
Brakstad O G, Maeland J A, Tveten Y.
Multiplex polymerase chain reaction for detection of genes for Staphylococcus aureus thermonuclease and methicillin resistance and correlation with oxacillin resistance.
APMIS.
1993;
101
681-688
-
15
Telenti A, Imboden P, Marchesi F, Schmidheini T, Bodmer T.
Direct, automated detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis by polymerase chain reaction and single-strand conformation polymorphism analysis.
Antimicrob. Agents Chemother..
1993;
37
2054-2058
-
16
Kwok S, Higuchi R.
Avoiding false positives with PCR.
Nature.
1989;
339
237-238
-
17
Lo Y M, Mehal W Z, Felming K A.
False-positive results and the polymerase chain reaction.
Lancet.
1988;
2
679
-
18
Cimino G D, Metchette K C, Tessman J W, Hearst J E, Isaacs S T.
Post-PCR sterilization: a method to control carryover contamination for the polymerase chain reaction.
Nucleic Acids Res..
1994;
19
99-107
-
19
Pang J, Modlin J, Yolken R.
Use of modified nucleotides and uracil-DNA glycosylase (UNG) for the control of contamination in the PCR-based amplification of RNA.
Mol. Cell Probes..
1992;
6
251-256
-
20
Meier A, Persing D H, Finken M, Böttger E C.
Elimination of contaminating DNA within polymerase chain reaction reagents: implications for a general approach to detection of uncultured pathogens.
J. Clin. Microbiol..
1993;
31
646-652
-
21
Cone R W, Hobson A S, Huang M.
Coamplified positive control detects inhibition of polymerase chain reactions.
J. Clin. Microbiol..
1992;
30
3185-3189
-
22 National Committee for Clinical Laboratory Standards. Molecular diagnostic methods for infectious diseases, approved guideline. NCCLS Document MM3-A 1995
-
23
Bitter-Suermann D.
Der Stellenwert der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) für die klinische Diagnostik von Infektionskrankheiten.
Dtsch. Ärztebl..
1993;
90 A1
3226-3230
-
24
Becker K, Peters G.
Moderne diagnostische Verfahren in der medizinischen Mikrobiologie.
Internist. Berl..
1995;
36
95-101
-
25 Roth A, Mauch H, Göbel U. Nukleinsäure-Amplifikationstechniken. In: MiQ: Qualitätsstandards in der mikrobiologisch-infektiologischen Diagnostik. Mauch H, Lütticken R, Gatermann (Hrsg). S. Gustav Fischer Verlag, Stuttgart Bd 1/97 1997
-
26
Becker K, Fegeler W.
Grundlagen der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) und ihre Einsatzmöglichkeiten in der medizinischen Mykologie.
Pilzdialog..
1996;
11
65-66
Dr. Karsten Becker
Westfälische Wilhelms-Universität Münster Institut für Medizinische Mikrobiologie
Domagkstraße 10
D-48149 Münster
