Zusammenfassung
Fragestellung: Die Differenzial Display Methode (DD) ist ein neues Screening-Verfahren für unterschiedlich exprimierte Gene auf RNA-Ebene. Wir beschreiben anhand eines neu identifizierten Gens sowie zweier bereits bekannter Gene die Bedeutung der Differenzial Display für die klinisch orientierte onkologische Grundlagenforschung. Methoden/Ergebnisse: Die Differenzial Display Methode basiert auf einem direkten Vergleich der Messenger-RNAs unterschiedlicher Zellpopulationen. Das methodische Grundprinzip der DD ist eine reverse Transkription der mRNA wobei sogenannte Anker-Primer zur Anwendung kommen. Anschließend folgt eine Gen-Amplifikation durch PCR wobei eine Kombination derselben Anker-Primer mit sogenannten Arbitrary-Primern verwendet werden. Neben PCR und reverser Transkription beinhaltet die Differenzial Display Methode grundlegende molekularbiologische Methoden wie RNA-Extraktion (aus klinischem Gewebe oder Zellkulturen), Northern Blot Analysen und Sequenzierungsverfahren. Mittels DD wurden acht unterschiedliche humane Krebszelllinien verglichen (Brust-, Magen-, Kolon-, Lungen-, Uterus- und Mundhöhlenkarzinome, Melanom, Neuroepitheliom). Dabei konnte mit Hilfe eines 18 Basen langen Arbitrary-Primers und eines 21 Basen langen Anker-Primers ein überexprimierter cDNA-Klon innerhalb der MCF 7 Brustkrebszelllinien identifiziert werden. Die anschließenden Subklonierungs- und Sequenzierungsanalysen sowie ein Vergleich mit der Gendatenbank identifizierte eine neue cDNA-Gensequenz von 380 Basenpaaren. Unter Verwendung des cDNA-Klones als radioaktiv markierte Sonde konnte das Ergebnis der DD in Northern-Blot-Analysen in Form einer mRNA-Überexpression in MCF 7 Brustkrebszellen bestätigt werden. Weitere Northern Blots zeigten eine verbreitete Expression des neuen Gens in Brustkrebszellen bei fehlender Expression in mehreren anderen Tumorzelllinien. Die Re-Amplifikation zweier ebenfalls unterschiedlich exprimierter cDNAs identifizierte zwei bereits bekannte Gene. Der eine cDNA-Klon kodiert für das Östrogenrezeptorprotein (ER), der andere Klon zeigte Übereinstimmung mit den kalziumbindenden Proteinen. Schlussfolgerung: Die DD ist eine geeignete Methode sowohl zur Identifikation neuer Gene als auch zum Vergleich unterschiedlich exprimierter Gene in verschiedenen Zellpopulationen. Wir beschreiben anhand der DD-Methode die Identifikation eines neuen, „brustkrebsassoziierten” Genes sowie zweier bereits bekannter jedoch unterschiedlich exprimierter Gene im Vergleich verschiedener humaner Tumorzelllinien.
Abstract
Objective: The differential display method is a new tool to screen for differentially expressed genes at the RNA level. The technique compares the expression of messenger RNAs by different cell populations. It involves reverse transcription of mRNA using an anchored primer design to bind to the poly-A-tail, followed by PCR amplification with an additional upstream arbitrary primer and visualization of the cDNA subpopulation with polyacrylamide gel electrophoresis. We describe the role of the differential display method in identifying a novel gene in human MCF 7 breast cancer cell lines and two previously established but differentially expressed genes.Methods: Gene expression was studied with the differential display method in eight human tumor cell lines (carcinomas of the breast, stomach, colon, lung, uterus, oral cavity and melanoma and neuroepithelioma).Results: Using an 18 bp arbitrary primer with a 21 bp anchored primer we identified a cDNA clone that was overexpressed in MCF 7 breast cancer cell lines. Cloning and sequence analysis of the cDNA clone and comparison with the Genbank/EMBL database identified a novel cDNA sequence of 380 base pairs. Using the cDNA fragment as a probe, Northern analysis was used to verify the differential display results and indicated an approximately 1.5 kb mRNA fragment that was overexpressed in MCF 7 cells. Reamplification of two additionally expressed cDNAs identified known genes, one encoding for the estrogen-receptor protein and the other for a calcium-binding protein. Conclusion: The differential display method is a useful technique to identify new genes and to compare the expression of genes in different cell populations.
Literatur
nmaass@uni-kiel.de
