Expression von AC133 vs. CD34 bei akuten Leukämien im Kindesalter[*]

Zusammenfassung:

AC133, ein neu entdecktes Stammzellantigen mit 5-transmembranen Domänen wird von 30 - 60 % aller CD34⁺-Zellen exprimiert. Wir haben uns daher zum Ziel gesetzt, zu untersuchen, ob und in welchem Ausmaß humane Stamm-/Progenitorzellen (HSPZ) des Nabelschnurblutes (NSB) sowie des peripheren Blutes (PB) vor oder nach G-CSF-Stimulation AC133 exprimieren. Schwerpunktmäßig haben wir Knochenmark-(KM)-Proben von akuten Leukämien zum Zeitpunkt der Erstdiagnose im Rezidiv und auch während einer kompletten Remission analysiert.

Die Expressionsanalysen wurden flowzytometrisch durchgeführt, wobei spezifische monoklonale Antikörper (AC133/1 und AC133/2 der Fa. Miltenyi Biotec GmbH) in Kombination mit dem Antikörper gegen CD34 (HPCA-2 der Fa. Becton Dickinson) verwendet wurden.

In bisherigen Untersuchungen haben wir im NSB von 43 Proben einen durchschnittlichen Anteil von 0,294 ± 0,165 % AC133⁺- vs. 0,327 ± 0,156 % CD34⁺-HSPZ gemessen. Im PB von 11 Probanden konnten max. 0,15 % CD34⁺- und auch AC133⁺-HSPZ nachgewiesen werden. Deutlich höher lag die Stammzellkonzentration im PB von Kindern mit unterschiedlichen Erkrankungen (Neuroblastom, Rhabdomyosarkom, ALL/AML), die für eine periphere Blutstammzelltransplantation (PBSZT) mit rhG-CSF vorbereitet worden waren. Es konnten bis zu 3,51 % AC133⁺-Zellen ermittelt werden, geringfügig höhere Werte (3,94 %) wurden für CD34⁺ festgestellt.

An insgesamt 128 KM-Proben haben wir AC133⁺- als auch CD34⁺-Zellen quantifiziert. 10 von diesen KM-Proben stammten von Patienten, bei denen eine Neoplasie nicht nachgewiesen werden konnte. Die CD34⁺-Zellen lagen zwischen 0,03 - 1,49 %; etwas geringer (bis 0,64 %) waren die Werte für AC133. KM-Proben von 53 Kindern mit akuter Leukämie wurden bei Erstdiagnose (41 ALL/12 AML) phänotypisiert und die Leukämieblasten auf AC133- und CD34-Expression überprüft. 32/41 (78 %) der lymphatischen Leukämieblasten waren CD34-positiv und 24/41 (58 %) exprimierten AC133. Interessanterweise konnten wir bei zwei Proben von ALL-Patienten eine AC133-Expression feststellen, jedoch keine CD34-Antigene. 42 % (5/12) der AML-Blasten exprimierten CD34 und nur 25 % (3/12) das Antigen AC133. Ähnliche Werte erhielten wir in der Rezidivgruppe (n=18). In der Gruppe der Leukämien, bei denen zum Zeitpunkt der Untersuchung eine Remission vorlag (n=47), konnten bis zu 5,55 % CD34⁺- und bis zu 1,25 % AC133-positive HSPZ ermittelt werden. Diese relativ hohen Werte dürften auf eine z. T. bestehende rhG-CSF-Stimulation zur rascheren Überwindung einer Aplasie zurückzuführen sein.

Aus unseren bisherigen Ergebnissen folgern wir, dass es sinnvoll erscheint, Quantifizierungen von CD34⁺-HSPZ durch den Nachweis von AC133 zu ergänzen. Dieser neue Stammzellmarker könnte im Rahmen einer autologen PBSZT als eine mögliche Alternative zu CD34 bei Verwendung einer MACS-Selektion in Betracht gezogen werden. AC133-negative Leukämien könnten im Falle eines unzureichenden Ansprechens auf die protokollgemäße Chemotherapie ebenfalls von einer PBSZT profitieren.

Abkürzungen:

AA Aplastische Anämie

ALL Akute Lymphoblastische Leukämie

AML Akute Myeloische Leukämie

CD Cluster of Differentiation

HSPZ Hämatopoetische Stamm- u. Progenitor-Zellen

KM Knochenmark

MNZ Mononukleäre ZellennAnzahl

NSB Nabelschnurblut

PB Peripheres Blut

PBSZT Periphere Blutstammzell-Transplantation

rhG-CSF rekombinanter humaner Granulozyten-Kolonie-Stimulierender Faktor

AC133, a newly discovered antigen on human progenitor cells, demonstrating 5-transmembraneous domains is expressed by 30 - 60 % out of all CD34⁺ cells. Our aim therefore was to investigate the extent of human stem-/progenitor cells expressing AC133 antigen in umbilical cord blood, peripheral blood without or following an application of granulocyte-colony stimulating factor (rhG-CSF). The main task was the investigation of bone marrow aspirates derived from children suffering from newly diagnosed acute leukemias, as well as from patients with a relapse or during a complete remission. The determination of antigen expression was done by application of flow cytometry (FACScan analysis) and the usage of newly developed monoclonal antibodies (AC133/1 and AC133/2; Miltenyi Biotec GmbH) in combination with monoclonal antibody directed against CD34-antigens (HPCA-2; BD).

Our studies till now show average percentages in umbilical cord blood derived from 43 newborns about 0.294 ± 0.165 % AC133⁺ vs. 0.327 ± 0.156 % CD34⁺ hematopoietic stem-/progenitor cells (HSPC). In peripheral blood from 11 healthy donors we verified up to 0.15 % CD34⁺ as well as AC133⁺ HSPC's. The concentration of progenitor cells was found to be obviously higher in peripheral blood from children with various diseases (neuroblastoma, rhabdomyosarcoma, ALL/AML) and undergoing application with rhG-CSF in order to be prepared for PBSC-transplantation. In those cases we found up to 3.51 % AC133⁺ cells as well as slightly higher values (3.94 %) for CD34 antigens.

Additionally we quantified 128 bone marrow (BM) samples for AC133⁺ and CD34⁺ cells. In 10 BM samples, derived from patients without any neoplasia, the CD34⁺ cells were about 0.03 % and 1.49 %, whereas AC133 values were up to 0.64 %. Bone marrow aspirates from 53 children with acute leukemias at time of diagnosis (ALL: n=41/AML: n=12) have been immunophenotyped and leukemic blast cells have been proved for AC133- and CD34 antigen expression. 32/41 (78 %) of lymphoblastic leukemic cells showed to be positive for CD34 antigen and 24/41 (58 %) demonstrated AC133 antigens. Interestingly there were 2 ALL-patients with pathological blast cells positive for AC133 but lacking of any CD34 antigens. 42 % (5/12) of investigated AML patients showed CD34⁺ phenotype, on the other hand there were only 25 % (3/12) with AC133⁺ phenotype. Similar values were found in relapsed patients (n=18). In BM samples from patients during complete remission (n=47) we could detect percentages up to 5.55 % for CD34 and up to 1.25 % for AC133 positive stem-/progenitor cells. Such quite high data may be explained by occasionally application of rhG-CSF therapy.

Our results till now lead to the conclusion, that it seems to be useful, to recruit quantification of CD34⁺ HPSC by additionally detecting AC133 antigens. This new stem cell marker (AC133) maybe of great value in case of autologous peripheral blood stem cell transplantation (PBSCT) because it could be an alternative to the usual CD34⁺ MACS selection system.

AC133 - ALL - AML - CD34 - hämatopoetische Stamm-/Progenitorzellen - Nabelschnurblut - autologe periphere Blutstammzelltransplantation - rhG-CSF - FACS-Analysen

AC133 - ALL - AML - CD34 - hematopoietic stem-/precursor cell - umbilical cord blood - autologous peripheral blood stem cell transplantation - rhG-CSF - FACS-analysis

Literatur

1 Unserem verehrten Chef, Herrn Professor Dr. med. Dr. h. c. Bernhard Kornhuber, gewidmet

• 01 Aiba  S, Tabata  N, Ishii  H, Ootani  H, Tagami  H. Dermatofibrosarcoma protuberans is a unique fibrohistiocytic tumour expressing CD34.  Br J Dermatol. 1992;  127 79-84
• 02 Baersch  G, Baumann  M, Ritter  J, Jürgens  H, Vormoor  J. Asynchronous expression of AC133 on CD34-negative leukemic blast cells in childhood B-cell precursor ALL.  In: Büchner T, Hiddemann W, Wörmann W, Ritter J (eds). Hematology and Blood Transfusion, Acute Leukemias VIII: Prognostic Factors and Treatment Strategies. Springer-Verlag, Berlin; 2000: in press
• 03 Baersch  G, Baumann  M, Ritter  J, Jürgens  H, Vormoor  J. Expression of AC133 and CD117 on candidate normal stem cell populations in childhood B-cell precursor acute lymphoblastic leukaemia.  B J Haematol. 1999;  107 572-580
• 04 Bene  M C, Castoldi  G, Knapp  W, Ludwig  W D, Matudes  E, Orfao  A, van't Veer  M B. Proposals for the immunological classification of acute leukemias. European group for the immunological characterization of leukemias (EGIL).  Leukemia. 1995;  9 1783-1786
• 05 Bühring  H J, Seiffert  M, Bock  T A, Scheding  S, Thiel  A, Scheffold  A, Kanz  L, Brugger  W. Expression of novel surface antigens on early hematopoietic cells.  Ann N Y Acad Sci. 1999;  872 25-38
• 06 Civin  C I, Strauss  L C, Brovall  C, Fackler  M J, Schwartz  J F, Shaper  J H. Antigenic analysis of hematopoiesis. III. A hematopoietic progenitor cell surface antigen defined by a monoclonal antibody raised against KG1a cells.  J Immunol. 1984;  133 157-165
• 07 Civin  C I, Trischmann  T, Kadan  N S, Davis  J, Noga  S, Cohen  K, Duffy  B, Groenewegen  I, Wiley  J, Law  P, Hardwick  A, Oldham  F, Gee  A. Highly purified CD34-positive cells reconstitute hematopoiesis.  J Clin Oncol. 1996;  14 2224-2233
• 08 Corbeil  D, Röper  K, Weigmann  A, Huttner  W B. AC133 hematopoietic stem cell antigen: human homologue of mouse kidney prominin or distinct member of a novel protein family?.  Blood. 1998;  91, 7 2625-2626 [Letter]
• 09 Ebener  U, Hakuba  S, Wehner  S, Stegmüller  M, Niegemann  E, Kornhuber  B, Schwabe  D. Phenotypic characterization of various CD34+ cell populations using anti-AC133.  Annals Hematol. 1998;  Supplement II, 77 153 [abstract no. 606]
• 10 Ebener  U, Wehner  S, Niegemann  E, Müller  M, Stegmüller  M, Kornhuber  B, Schwabe  D. AC 133: Eine mögliche Alternative beim Einsatz einer peripheren Blut-Stammzelltransplantation?.  Med Klinik. 1999;  94 125 [Abstrakt Nr. P-186]
• 11 Ebener  U, Wehner  S, Niegemann  E, Kornhuber  B, Schwabe  D. Expression of AC133 on childhood acute leukemia. In: . Büchner T, Hiddemann W, Wörmann W, Ritter J (eds). Hematology and Blood Transfusion, Acute Leukemias VIII Prognostic Factors and Treatment Strategies. Springer-Verlag, Berlin; 2000: [in press]
• 12 Ebener  U, Wehner  S, Brinkmann  A, Niegemann  E, Kornhuber  B. Expression of AC133 vs. CD34 on acute leukemias.  Klin Pädiatr. 1999;  211 364 [abstract]
• 13 Ebener  U, Wehner  S, Brinkmann  A, Niegemann  E, Zotova  V, Kornhuber  B. Comparison of the Expression of AC133 and CD34 in childhood acute leukemia.  Onkologie. 1999;  22 suppl 1 106 [abstract no. 0391]
• 14 Fauth  F, Martin  H, Weidmann  E, Schneider  B, Sonnhoff  S, Hoelzer  D. Expression of AC133 in de novo acute myeloid leukemia (AML): Correlation with FAB-Subtype.  Experimental Hematology. 1999;  Vol 27, No7, suppl 1 75 [abstract]
• 15 Gehling  U M, Ergün  S, Schuch  G, Schafhausen  P, Kilic  N, Schäfer  B, Hossfeld  D K, Fiedler  W. Generation of endothelial cells (EC) from AC133-positive progenitor cells.  Onkologie. 1999;  Suppl. II, 22 [abstract no. 1027]
• 16 Gutensohn  K, Serke  S. Durchflußzytometrische Analyse CD34-exprimierender hämatopoetischer Zellen in Blut und Zytaphereseprodukten.  Infusionsther Transfusionsmed. 1996;  23, Suppl. 2 1-23
• 17 Häfer  R, Voigt  A, Gruhn  B, Zintl  F. Neuroblastoma cells can express the hematopoietic progenitor cell antigen CD34 as detected at surface protein and mRNA level.  J Neuroimmunology. 1999;  96 201-206
• 18 Handgretinger  R, Greil  J, Schürmann  U, Lang  P, Gonzalez-Ramella  O, Schmidt  I, Fuhrer  R, Niethammer  D, Klingebiel  T. Positive selection and transplantation of peripheral CD34+ progenitor cells: feasibility and purging efficacy in pediatric patients with neuroblastoma.  J Hematother. 1997;  6 235-242
• 19 Handgretinger  R, Lang  P, Schumm  M, Tailor  C, Neu  S, Koscielnak  E, Niethammer  D, Klingebiel  T. Isolation and transplantation of autologous peripheral CD34+ progenitor cells highly purified magnetic-activated cell sorting.  Bone Marrow Transpl. 1998;  21 987-993
• 20 Horn  P A, Tesch  H, Staib  P, Kube  D, Diehl  V, Voliotis  D, Schoch  C. Expression of AC133, a novel hematopoietic precursor antigen, on acute myeloid leukemic cells.  Blood. 1999;  93, 4 1435-1437 [Correspondence]
• 21 Katz  F, Tindle  R W, Sutherland  D R, Greaves  M D. Identification of a membrane glycoprotein associated with hemopoietic progenitor cells.  Leuk Res. 1985;  9 191-198
• 22 Kratz-Albers  K, Zühlsdorf  M, Leo  R, Berdel  W E, Serve  H. Expression of AC133, a novel stem cell marker, on human leukemic blasts lacking CD34(-) antigen and on human CD34(+) leukemic cell line: MUTZ-2.  Blood. 1998;  92, 11 4485-4487 [Correspondence]
• 23 Krause  D S, Fackler  M J, Civin  C I, May  W S. CD34: Structure, biology, and clinical utility.  Blood. 1996;  87 1-13
• 24 Kuci  S, Schumm  M, Seitz  G, Lang  P, Grau  R, Niethammer  D, Handgretinger  R. Enrichment and ex vivo expansion of mobilized peripheral blood AC133 hematopoietic stem cells.  Fourth Meeting of European Haematology Association Barcelona; 9. - 12. Juni 1999: [abstract]
• 25 Lode  H N, Handgretinger  R, Schuermann  U, Seitz  G, Klingebiel  T, Niethammer  D, Beck  J. Detection of neuroblastoma cells in CD34+ selected peripheral stem cells using a combination of tyrosine hydroxylase nested RT-PCR and ganglioside GD2 immunocytochemistry.  Eur J Cancer. 1997;  33 2024-2030
• 26 Miraglia  S, Godfrey  W, Yin  A H, Atkins  K, Warnke  R, Holden  J T, Bray  R A, Waller  E K, Buck  D W. A novel five-transmembrane hematopoietic stem cell antigen: isolation, characterization, and molecular cloning.  Blood. 1997;  90, 12 5013-5021
• 27 Miraglia  S, Godfrey  W, Buck  D W. A response to AC133 hematopoietic stem cell antigen: human homologue of mouse kidney prominin or distinct member of a novel protein family?.  Blood. 1998;  91, 11 4390-4391 [Letter]
• 28 Miltenyi  S, Müller  W, Weichel  W, Radbruch  A. High gradient magnetic cell separation with MACS.  Cytometry. 1990;  11 231-238
• 29 Moss  T J, Sanders  D G, Lasky  L C, Bostrom  B. Contamination of peripheral blood stem cell harvests by circulating neuroblastoma cells.  Blood. 1990;  76 1879-1883
• 30 Neu  S, Geiselhart  A, Kuci  S, Baur  F, Niethammer  D, Handgretinger  R. Isolation and phenotypic characterization of CD117-positive cells.  Leuk Res. 1996;  30 963-971
• 31 Peichev  M, Naiyer  A J, Pereira  D, Zhu  Z, Lane  W J, Williams  M, Oz  M C, Hicklin  D J, Witte  L, Moore  M A, Raffi  S. Expression of VEGFR-2 and AC133 by circulating human CD34+ cells identifies a population of functional endothelial precursors.  Blood. 2000;  95, 3 952-958
• 32 Pettengell  R, Pearce  D, Gordon-Smith  E C, McGuckin  C, Marsh  J CW. AC133 selects an earlier haematopoietic subset than CD34.  40th Annual Meeting of the American Society of Hematology 1998 [abstract no. 1830]
• 33 Pui  C H, Hancock  M L, David  R, Rivera  G K, Look  A T, Sandlund  J T, Behm  F G. Clinical Significance of CD34 Expression in Childhood acute lymphoblastic Leukemia.  Blood. 1993;  82 889-894
• 34 Rothe  G, Schmitz  G, Adorf  D, Barlage  S, Gramatzki  M, Hanenberg  H, Höffkes  H G, Janossy  G, Knüchel  R, Ludwig  W D, Nebe  T, Nerl  C, Orfao  A, Serke  S, Sonnen  R, Tichelli  A, Wörmann  B. Consensus protocol for the flow cytometric immunophenotyping of hematopoietic malignancies.  Leukemia. 1996;  10 877-895
• 35 Scott  M A, Bloxham  D M, Jestice  H K, Marcus  R E, Craig  J IO. AC133 Expression on mobilised peripheral blood progenitor cells. Fourth Meeting of the European Haematology Association Barcelona; 9. - 12. Juni: [abstract]
• 36 Siena  S, Bregni  M, Gianni  M. Estimation of peripheral blood CD34+ cells for autologous transplantation in cancer patients.  Exp Hematol. 1993;  21 203-205
• 37 Snell  V, Jackson  E, Buck  D, Adreeff  M. Expression of the AC133 antigen in leukemic and normal progenitors. 40th Annual Meeting of the American Society of Hematology (1998) [abstract no. 483]
• 38 Sperling  C, Büchner  T, Creuzig  U, Ritter  J, Harbott  J, Fonatsch  C, Sauerland  C, Mielcarek  M, Maschmeyer  G, Löffler  H, Ludwig  W D. Clinical, morphologic, cytogenetic and prognostic implications of CD34 expression in childhood and adult de novo AML.  Leuk and Lymph. 1995;  17 417-426
• 39 Tschirkov  A, Kanold  J, Giollant  M, Halle-Haus  P, Berger  M, Rapatel  C, Lutz  P, Bergeron  C, Plantaz  D, Vannier  J-P, Stephan  J-L, Favrot  M, Bordigoni  P, Malet  P, Briancon  G, Demeocq  F. Molecular monitoring of tumor cell contamination in leukapheresis products from stage IV neuroblastoma patients before and after positive CD34 selection.  Med Pediatr Oncol. 1998;  30 228-232
• 40 Viehmann  K, von Neuhoff  N, Schmitz  N, Dreger  P. Purging of PBSC autografts from patients with CLL by positive selection via the AC133 antigen: Preclinical data. Annals of Hematology 1998, Supplement II, 77 [abstract no. 156]
• 41 Voigt  A, Häfer  R, Gruhn  B, Zintl  F. Expression of CD34 and other haematopoietic antigens on neuroblastoma cells: consequences for autologous bone marrow and peripheral blood stem cell transplantation.  J Neuroimmunol. 1997;  78 117-126
• 42 Westra  W H, Gerald  W L, Rosai  J. Solitary fibrous tumor. Consistent CD34 immunoreactivity and occurrence in the orbit.  Am J Surg Pathol. 1994;  18 992-998
• 43 de Wynter  E A, Hart  C, Coutinho  L H, Gagen  D, Chang  J, Buck  D, Testa  N G. Analysis of human haemopoietic cells isolated with the novel AC133 monoclonal antibody. ISEH-Meeting Vancouver; 1998: [abstract no. 214]
• 44 de Wynter  E A, Buck  D, Hart  C, Heywood  R, Coutinho  L H, Clayton  A, Rafferty  J A, Burt  D, Guenechea  G, Bueren  J A, Gagen  D, Fairbairn  L J, Lord  B I, Testa  N G. CD34(+) AC133(+) cells isolated from cord blood are highly enriched in long-term culture-initiating cells, NOD/SCID-repopulating cells and dendritic cell progenitors.  Stem Cells. 1998;  16, 6 387-396
• 45 Yin  A H, Miraglia  S, Zanjani  E D, Almeida-Porada  G, Ogawa  M, Leary  A G, Olweus  J, Kearney  J, Buck  D W. AC133, a novel marker for human hematopoietic stem and progenitor cells.  Blood. 1997;  90, 12 5002-5512
• 46 Yin  A H, Phi-Wilson  J, Zeng  Y, Ware  B, Sheehan  K, Recktenwald  D, Law  P. Large scale AC133+ cell selection with MACS technology, (1998) [abstract no. 1820].