Untersuchungen zur DNA-Reparatur von Schleimhautzellen und Lymphozyten mit dem Comet Assay

Zusammenfassung

Hintergrund: Neben exogenen Einflüssen liegen der Entstehung von Karzinomen im Kopf-Hals-Bereich zahlreiche endogene Risikofaktoren zugrunde, wie z. B. die Mutagensensitivität, d. h. die Empfindlichkeit gegenüber Fremdstoffeinwirkungen auf die DNA, sowie die Reparaturfähigkeit für solche Schädigungen. Der DNA-Reparatur liegen unterschiedliche Zellsysteme und -mechanismen zugrunde, die Einfluss auf Mutationsvorgänge und somit auf die Entstehung von malignen Transformationen haben. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, das Reparaturverhalten von humanen Schleimhautzellen und Lymphozyten mit einem sensitiven Verfahren darzustellen. Methode: Humane Epithelien der Nase und periphere Lymphozyten wurden mit dem Tabakkarzinogen N'Nitrosodiethylamin (NDEA) inkubiert und nach 0 min, sowie Reparaturintervallen von 15 min und 30 min einer modifizierten Version der alkalischen Mikrogelelektrophorese (Comet Assay) unterworfen. Als Negativkontrolle diente das Lösungsmittel Dimethylsulfoxid (DMSO). Die Auswertung erfolgte mittels Fluoreszenzmikroskop und digitaler Bildverarbeitung. Ergebnisse: Mit dem Comet Assay konnten sowohl an humanen Schleimhautzellen als auch an Lymphozyten Reparaturvorgänge quantitativ dargestellt werden. Die Zellvitalitäten lagen nach Fremdstoffinkubation zwischen 90 % und 100 %. Der Hauptanteil der durch NDEA induzierten Schädigungen war in den ersten 15 min in beiden Zellpopulationen repariert. Eine weitere Erholung fand in den darauffolgenden 15 min statt. Schlussfolgerung: Der Comet Assay wurde bislang vorwiegend für die Darstellung substanzinduzierter DNA-Schädigungen eingesetzt. Untersuchungen zur DNA-Reparatur wurden schon an Bakterien, tierischen Zellsystemen und Lymphozyten durchgeführt. Die vorliegende Analyse zeigt aber auch die Möglichkeit auf, an humanen Schleimhautzellen der Nase als Zielorgan volatiler Karzinogene und an Lymphozyten Reparaturvorgänge quantitativ zu beschreiben. Somit kann neben der Messung der Mutagensensitivität ein weiterer endogener Faktor in der Entstehung maligner Tumoren des oberen Aerodigestivtraktes dargestellt werden.

DNA-Repair Capacity of Human Mucosal Cells and Lymphocytes Demonstrated by the Comet Assay

Background: Exogenous and endogenous risk factors are involved in human carcinogenesis of the head and neck. Noteworthy hereditary factors include mutagen sensitivity and the individual's capacity for DNA repair. Repair mechanisms influence different phases of mutation and malignant transformation. The present study introduces a highly sensitive method for evaluating the repair capacity of human mucosal cells and lymphocytes. Method: Human epithelia of the nose and peripheral lymphocytes were incubated with the tobacco-related carcinogen N'nitrosodiethylamine (NDEA). The solvent dimethylsulfoxide (DMSO) served as negative control. Following repair times of 0 min, 15 min and 30 min, the cells were subjected to a modified version of the alkaline microgel electrophoresis technique (Comet assay). The data were digitally analyzed after fluorescent staining. Results: Using the Comet assay, DNA repair could be quantified in human mucosal cells and in lymphocytes. The majority of DNA strand breaks induced by NDEA were repaired within 15 min in both cell types. Conclusions: Up to now, the Comet assay has been the preferred method for demonstrating substance-induced DNA damage. It has been used in repair studies involving lymphocytes, bacterial systems and animal-derived cells. A modified version of this method, however, can be used to quantify DNA repair in human mucosal cells and peripheral lymphocytes targeted by carcinogens. It is thus possible to evaluate an endogenous factor involved in the development of malignant transformations in mucosal cells of the upper aerodigestive tract.

DNA-Reparatur - Comet Assay - Schleimhaut - Lymphozyten - N'Nitrosodiethylamin

DNA repair - Comet assay - Lymphocytes - Human mucosa - N'nitrosodiethylamine

Literatur

• 01 Bock C, Dittmar H, Gemeinhardt H, Bauer E, Greulich K O. Comet assay detects cold repair of UV-A damages in a human B-lymphoblast cell line.  Mutat Res. 1998;  408 111-120
• 02 Lankinen M H, Vilpo L M, Vilpo J A. UV- and gamma-irradiation-induced DNA single-strand breaks and their repair in human blood granulocytes and lymphocytes.  Mutat Res. 1996;  352 31-38
• 03 Cloos J, Spitz M R, Schantz S P, Hsu T C, Zhang Z, Tobi H, Braakhuis B JM, Snow G B. Genetic susceptibilities to Head and Neck Squamous Cell Carcinoma.  J Nat Cancer Inst. 1996;  88 530-534
• 04 Collins A R, Ma A G, Duthie S J. The kinetics of repair of oxidative DNA damage (strand breaks and oxidised pyrimidines) in human cells.  Mutat Res. 1995;  336 69-77
• 05 Cheng L, Eicher S A, Guo Z, Hong W K, Spitz M R, Wie Q. Reduced DNA repair capacity in head and neck cancer patients.  Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 1998;  7 465-468
• 06 Alapetite C, Thirion P, de la Rochefordiere A, Cosset J M, Moustacchi E. Analysis by alkaline comet assay of cancer patients with severe reactions to radiotherapy: defective rejoining of radioinduced DNA strand breaks in lymphocytes of breast cancer patients.  Int J Cancer. 1999;  83 83-90
• 07 Visvardis E E, Tassiou A M, Piperakis S M. Study of DNA damage induction and repair capacity of fresh and cryopreserved lymphocytes exposed to H₂O₂ and γ-irradiation with the alkaline comet assay.  Mutat Res. 1997;  383 71-80
• 08 Kleinsasser N H, Kastenbauer E R, Weissacher H, Muenzenrieder R K, Harréus U A. Phthalates demonstrate genotoxicity on human mucosa of the upper aerodigestive tract.  Environ Molec Mutagen. 2000;  35 9-12
• 09 Olive P L, Banath J P. Induction and rejoining of radiation-induced DNA single-strand breaks: “tail moment” as a function of position in the cell cycle.  Mutat Res. 1993;  294 275-283
• 10 Rajaee-Behbahani N, Müller-Vogt U, Gliniorz R, Engelhardt E, Bartsch H, Schmezer P. Effect of long term cryopreservation on mutagen sensitivity and DNA-repair capacity of peripheral blood lymphocytes.  J Cancer Res Clin Oncol. 1999;  125 (S) 32
• 11 Cotelle S, Férard J F. Comet assay in genetic ecotoxicology: a review.  Environ Molec Mutagen. 1999;  34 246-255
• 12 Speit G, Hartmann A. The comet assay (single-cell gel test). A sensitive genotoxicity test for the detection of DNA damage and repair.  Methods Mol Biol. 1999;  113 203-212
• 13 Harréus U A, Schmezer P, Kuchenmeister F, Maier H. Genotoxische Wirkung auf menschliche Schleimhautbiopsien des oberen Aerodigestivtraktes.  Laryngo-Rhino-Otol. 1999;  78 176-181
• 14 Kleinsasser N H, Harréus U A, Wallner B C, Kastenbauer E R. Mutagensensitivität von Patienten mit Larynx- bzw. Oropharynxkarzinomen.  Laryngo-Rhino-Otol. 1999;  78 379-384
• 15 Weitberg A B, Corvese D. Oxygen radicals potentiate the genetic toxicity of tobacco-specific nitrosamines.  Clin Genet. 1993;  43 88-91
• 16 Anderson D, Yu T W, Hincal F. Effect of some phthalate esters in human cells in the comet assay.  Teratog Carcinogen Mutagen. 1999;  19 275-280
• 17 Kleinsasser N H, Weissacher H, Wallner B C, Kastenbauer E R, Harréus U A. Zytotoxizität und Genotoxizität von Fluoriden in humaner Mukosa und Lymphozyten.  Laryngo-Rhino-Otol. im Druck; 
• 18 Mendiola-Cruz M T, Morales-Ramirez P. Repair kinetics of gamma-ray induced DNA damage determined by the single cell gel electrophoresis assay in murine leukocytes in vivo.  Mutat Res. 1999;  433 45-52
• 19 Sancar A, Sancar G B. DNA repair enzymes.  Annu Rev Biochem. 1988;  57 29
• 20 Sancar A. Mechanisms of DNA excision repair.  Science. 1994;  266 1954