Mouse-Isolated Plexus Differentiates Neural Crest Precursors into Enteric Neuroblasts

Abstract

Aim of this study was to investigate, for the first time, whether isolated newborn mouse enteric plexus could induce in vitro differentiation of the vagal neural crest-derived cells into enteric neuroblasts.

Fragments of the myenteric plexus were isolated from the small intestine of 6-day-old Swiss mice and were collected and stored in DMEM-F12 medium, then cultured on polymerized human fibronectin layer. The vagal portion of the neural tube, isolated from a 9.5-day-old Swiss mouse embryo, was put in the same chamber slides where the isolated myenteric plexus had been cultured for 3 days. The vagal neural crest-derived cells migrated onto the polymerized human fibronectin layer and formed a crown of cells around the neural tube. After 6 days, the cultures were stopped and studied immunohistochemically for anti-NF160 KD, anti-TH, and RetR5 antibodies to analyse the differentiation stage of the cultured cells.

Analysis of results included the comparison of two culture groups: Group 1, used as control, in which vagal neural crest-derived cells were put in DMEM-F12, supplemented only with 10 % of FCS; Group 2, in which vagal neural crest-derived cells were put in the same medium as Group 1, with the addition of myenteric plexus fragments isolated from newborn mice to form the co-culture. The following results were obtained: in Group 1 the neural tubes originated a cell population strongly positive for anti-NF160 and anti-TH Ab, but negative for RetR5 Ab. This positivity was found both in the cells adjacent to the neural tube and in those migrating from it distally. The Group 2 originated cells, which after migration were positive for anti-NF160 and for anti-TH antibodies. In addition, in this culture group, the cells which migrated from the neural tube were positive for anti-RetR5 antibody.

The co-culture used in this study induces the differentiation of vagal stem cells into enteric neuroblasts, cells TH+ and RetR5+. These cells, after reaching the embryonic intestine, migrate to colonize the hindgut and form the ENS. Therefore this biotechnology seems a good method to obtain in vitro enteric precursors of ENS.

Résumé

Le but de cette étude est d'apprécier pour la première fois si le plexus entérique de souris nouveau-né isolé peut induire in-vitro la différenciation de la crête neurale vers des neuroblastes entériques.

Des fragments de plexus myentériques étaient isolés de l'intestin de souris Swiss de 6 jours de vie et étaient conservés dans un milieu DMEM-F12, puis cultivés sur un support de fibronectine humaine polymerisé. La portion sympathique du tube neural, isolée chez un embryon de souris Swiss de 9,5 jours était posé dans la même culture avec le plexus myentérique isolé et était cultivé pendant 3 jours. Les cellules de la crête neurale sympathique migraient dans le plan de Fibronectine humaine polymérisée et constituaient une couronne de cellules autour du tube neural. Après 6 jours, les cultures étaient stoppées et une étude immuno-histo-chimique par anti-NF160 KD, anti-TH et anticorps RetR5 pour analyser les différents stades des cellules cultivées était réalisée.

L'analyse des résultats incluait la comparaison de deux groupes de culture: Groupe 1 utilisé comme contrôle, dans lequel les cellules dérivées de la crête neurale sympathique étaient posées dans un milieu DMEM-F12 supplémenté seulement avec 10 % de FCS; Groupe 2 dans lequel les cellules dérivées de la crête neurale sympathique étaient posées dans le même milieu que le Groupe 1 avec en plus les fragments isolés de plexus myentérique de souris nouveau-né pour réaliser la co-culture. Les résultats suivants étaient obtenus: dans le groupe 1, le tube neural produisait une population cellulaire fortement positive pour anti-NF160 et anti-TH Ab mais négatif pour RetR5 Ab. Cette positivité était trouvée à la fois dans les cellules proches du tube neural et dans celles migrant en périphérie. Les cellules du Groupe 2 après migration étaient positives pour anti-NF160 et les anticorps anti-TH. De plus, dans ce groupe de culture, les cellules ayant migré du tube neural étaient positives pour les anticorps anti-RetR5.

La co-culture utilisée dans cette étude induit la différenciation de cellules sympathiques en neuroblastes entériques, cellules TH+ et RetR5 +. Ces cellules, comme c'est connue, après avoir atteint l'intestin embryonnaire, migrent et colonisent l'intestin et forment l'ENS. Cette biotechnologie semble une bonne méthode pour obtenir in-vitro des précurseurs entériques d'ENS.

Resumen

El objetivo de este estudio es investigar por primera vez si el plexo entérico aislado del ratón recién nacido puede inducir diferenciación in vitro de las células de la cresta neural vagal hacia neuroblastos entéricos.

Se aislaron fragmentos del plexo mientérico del intestino delgado de ratones Swiss de 6 días que se conservaron en medio DMEM-F12 y se cultivaron en una capa de fibronectina humana polimerizada. La porción vagal del tubo neural aislado de ratones Swiss de 9.5 días de edad se puso en las mismas cámaras donde se habían cultivado los plexos mientéricos durante 3 días. Las células derivadas de la cresta neural vagal emigraron en la capa de fibronectina polimerizada humana y formaron una corona de células alrededor del tubo neural. Tras 6 días los cultivos se detuvieron y se estudiaron inmunohistoquímicamente para anticuerpos anti-NF160 KD, anti-TH y retR5 con el fin de analizar los estadios de diferenciación de las células cultivadas.

El análisis de los resultados incluye la comparación de dos grupos de cultivo: Grupo 1, usado como control, en el cual las células derivadas de la cresta neural vagal se pusieron en DMEM-F12 suplementado con solamente 10 % de FCS. Grupo 2, en el cual las células derivadas de la cresta neural vagal se pusieron en el mismo medio que en el Grupo 1 pero añadiendo fragmentos de plexos mientéricos aislados de los ratones recién nacidos para formar un co-cultivo. Se obtuvieron los siguientes resultados: En el Grupo 1 los tubos neurales originaron una población celular fuertemente positiva para anticuerpos anti-NF160 y anti-TH, pero negativa para retR5. Esta positividad fue encontrada tanto en las células adyacentes al tubo neural como en las que emigraron desde él distalmente. El Grupo 2 originó células que después de emigrar fueron positivas para anti-NF160 y para anticuerpos anti-TH. Además, en este grupo de cultivo las células migraron desde el tubo neural y eran positivas para anticuerpos anti retR5.

El co-cultivo usado en este estudio indujo la diferenciación de las células vagales primitivas hacia neuroblastos entéricos, células TH+ y retR5 +. Estas células, como es conocido, tras alcanzar el intestino embrionario emigran para colonizar el intestino distal y formar el sistema nervioso entérico. Por lo tanto, esta biotecnología parece un buen método para obtener in vitro precursores entéricos del sistema nervioso entérico.

Zusammenfassung

Ziel der Studie ist es, erstmalig zu untersuchen, ob der isolierte Plexus myentericus von Mäusen in vitro eine Differenzierung vagaler, neuraler Stammzellen in enterische Neuroblasten zu induzieren vermag.

Hierzu wurden Fragmente des Plexus myentericus aus dem Dünndarm 6 Tage alter Schweizer Mäuse isoliert, gesammelt und in einem DMEM-F12-Medium inkubiert. Danach wurden sie auf einer polymerisierten menschlichen Fibronectinschicht kultiviert. Der vagale Anteil des Rückenmarks wurde von 9,5 Tage alten Schweizer Mäuseembryonen isoliert und in dieselbe Brutkammer, in der der isolierte Plexus myentericus 3 Tage lang kultiviert worden war, eingebracht. Die vagalen Rückenmarkszellen wanderten in die polymerisierte menschliche Fibronectinschicht und bildeten Kronen von Zellen um das Rückenmark. Nach 6 Tagen wurden die Kulturen entnommen und histochemisch auf Anti-NF160 KD, Anti-TH und RetR5-Antikörper untersucht, um das Differenzierungsstadium der gezüchteten Stellen zu analysieren.

Zwei Zellkulturgruppen wurden dabei unterschieden: Gruppe 1 (Kontrollgruppe). Hierbei wurden die vagalen Rückenmarkszellen nur in DMEM-F12 mit 10 % FCS inkubiert. In Gruppe 2 wurden die vagalen Rückenmarkszellen im selben Medium wie Gruppe 1 inkubiert, jedoch zusätzlich Fragmente des Plexus myentericus der neugeborenen Mäuse als Ko-Kultur eingebracht.

Ergebnisse

In Gruppe 1 waren die Rückenmarkszellen stark positiv für Anti-NF160 und Anti-TH Ab, jedoch negativ für RetR5 Ab. Diese Positivität fand sich sowohl in den rückenmarksnahen Zellen wie auch in denen, die weiter nach distal gewandert waren. In Gruppe 2 fanden sich Zellen, die nach ihrer Migration Anti-NF160- und Anti-TH-Antikörper-positiv waren. Darüber hinaus waren in dieser Zellkultur diejenigen Zellen, die vom Rückenmark weggewandert waren, positiv für Anti-RetR5 Antikörper.

Schlussfolgerung

Die Ko-Kultur, welche in dieser Studie verwandt wurde, induzierte die Differenzierung von vagalen Stammzellen in enterische Neuroblasten, d. h. Zellen, die TH+ und RetR5 + waren. Diese Zellen wandern, wie bekannt, in den embryonalen Dünndarm und besiedeln die Darmwand unter Bildung des enteralen Nervensystems. Aus diesem Grunde scheint die beschriebene Biotechnologie eine gute Methode zu sein, um in vitro enterische Vorläufer des enteralen Nervensystems zu untersuchen.

Key words

Enteric nervous system - Tyrosine hydroxylase - Ret protein - Neurofilaments - Hirschsprung's disease

Mots-clés

Système nerveux entérique - Tyrosine hydroxylase - Protéine RET - Maladie de Hirschsprung

Mots-clés

Sistema nervioso entérico - Tirosin-hidroxilasa - Proteina Ret - Neurofilamentos - Enfermedad de Hirschsprung

Schlüsselwörter

Enterales Nervensystem - Rückenmarksstammzellen - Neuroblasten - In-vitro-Kulturen - Hirschsprung-Krankheit

References

• 1 Baetage G, Pintar J E, Gershon M D. Transiently catecholaminergic enteric neurons.  Dev Biol. 1990;  141 353-380
• 2 Edery P, Lyonnet S, Mulligan L M, Pelet A, Dow E, Abel L, Holder S, Nihoul-Fekété C, Ponder B AJ, Munnich A. Mutations of a RET proto-oncogene in Hirschsprung's disease.  Nature. 1994;  367 378-380
• 3 Epstein M L, Mikawa T, Brown A MC, McFarlin D R. Mapping the origin of the avian enteric nervous system with a retroviral marker.  Dev Dyn. 1994;  201 236-244
• 4 Gershon M D, Chalazonitis A, Rothman T P. From neural crest to the bowel: development of enteric nervous system.  J Neurobiol. 1993;  24 199-214
• 5 Lo L, Anderson D. Postmigratory neural crest cells expressing c-RET display restricted developmental and proliferative capacities.  Neuron. 1995;  15 527-539
• 6 Martucciello G, Tam P KH. RET protein in human fetal development and in Hirschsprung's disease. Holschneider AM, Puri P Hirschsprung's Disease and Allied Disorders. Harwood Academic Publisher 2000: 81-88
• 7 Maxwell G D, Reid K, Elefanty A, Barlett P F, Murphy M. Glial cell-line derived neurotrophic factor promotes the development of adrenergic neurons in mouse neural crest cultures.  PNAS USA. 1996;  93 13274-13279
• 8 Pachnis V, Mankoo B, Costantini F. Expression of the c-ret proto-oncogene during mouse embryogenesis.  Development. 1993;  119 1005-1017
• 9 Romeo G, Ronchetto P, Luo Y, Barone V, Seri M, Ceccherini I, Pasini B, Bocciardi R, Lerone M, Kaariainen H, Martucciello G. Point mutation affecting the tyrosine kinase domain of the RET proto-oncogene in Hirschsprung's disease.  Nature. 1994;  367 377-378
• 10 Schäfer K-H, Saffrey M J, Burnstock G, Mestres-Ventura P. A new method for isolation of myenteric plexus from the newborn rat gastrointestinal tract.  Brain Res Prot. 1997;  1 109-113
• 11 Schuchardt A, D'Agati V, Larsson-Blomberg L, Costantini F, Pachnis V. Defects in the kidney and enteric nervous system of mice lacking the tyrosine kinase receptor Ret.  Nature. 1994;  367 380-383
• 12 Takahashi M, Buma Y, Hiai H. Isolation of ret proto-oncogene cDNA with an amino-terminal signal sequence.  Oncogene. 1989;  4 805-806
• 13 Tam P KH, Gould S J, Martucciello G, Biddolph S, Takahashi M, Jasonni V. Ret protein in the human fetal rectum.  J Pediatr Surg. 1996;  31 568-571