Effects of Nitric Oxide Synthase Inhibition on Intestinal Damage in Rats with Experimental Necrotizing Enterocolitis

Abstract

In the inflamed intestinal mucosa of necrotizing enterocolitis (NEC), nitric oxide (NO) generated by inducible nitric oxide synthase (iNOS) may contribute to the pathogenesis of local intestinal damage. To study the importance of iNOS for the pathogenesis of NEC, the effects of selective (aminoguanidine, AG) and nonselective (l-nitroarginine methyl ester, L-NAME) iNOS inhibitors on intestinal morphologic changes were assessed in neonatal rats with experimental NEC.

The neonatal rats were randomized into one of the five treatment groups. The control group consisted of rats that were breast-fed. The NEC group, consisting of neonates separated from their mothers, were gavaged with a special rodent formula to produce NEC. Rats in the sham, the AG, and the L-NAME groups were gavaged in a similar fashion to those in the NEC group; in addition, they were treated with 0.9 % saline, 10 mg/kg/day AG, and 10 mg/kg/day L-NAME, respectively. The rats were sacrificed on day 4, and the last 4 cm of terminal ileum was harvested for morphological studies and detection of nitrite and nitrate levels in tissue.

The animals in the NEC and sham groups showed various degrees of intestinal inflammatory changes and increased tissue levels of nitrite and nitrate compared to those in the control group. Both AG and L-NAME treatment decreased the tissue levels of these nitrogen oxides, but the inflammatory changes of the intestine appeared to be attenuated only in the AG treated animals. L-NAME treatment did not improve the intestinal damage and increased mortality.

These results may indicate that NO synthesized by iNOS plays a pathogenic role in formula-fed induced NEC and that inhibition of iNOS improves intestinal inflammatory damage.

Résumé

Dans la muqueuse intestinale inflammatoire de l'entérocolite nécrosante (NEC), l'oxyde nitrique (NO) généré par la nytric oxide synthase (iNOS) peut contribuer à la pathogénie des dommages intestinaux locaux. Pour étudier l'importance de iNOS dans la pathogénie de NEC, les effets inhibiteurs iNOS spécifiques (aminoguanidine, AG) et non spécifiques (l-nitroarginine methyl ester, L-NAME) sont appréciés chez le rat nouveau-né avec une NEC expérimentale.

Les rats nouveau-nés étaient partagés en cinq groupes thérapeutiques. Le groupe contrôle était constitué de rats qui étaient alimentés au lait maternel. Le groupe NEC était constitué de nouveau-nés séparés de leur mère, nourris avec une formule spéciale pour produire NEC. Le groupe fantôme, le groupe AG, et le groupe L-NAME étaient gavés de manière similaire au groupe NEC; de plus, ils étaient traités avec respectivement une solution à 0.9 % de sérum physiologique, 10 mg/kg/j AG et 10 mg/kg/j L-NAME. Les rats étaient sacrifiés au 4^ème jour et les 4 derniers cm de l'iléon terminal étaient préservés pour une étude morphologique et détection du taux de nitrites et nitrates. Les animaux dans le groupe NEC et fantôme montraient des degrés variable d'inflammation de la muqueuse intestinale et un taux élevé de nitrites et nitrates comparé à ceux du groupe contrôle. A la fois le traitement AG et L-NAME diminuait le niveau de ces acides nitriques mais les modifications inflammatoires de l'intestin paraissaient être atténuées seulement chez les animaux traités par AG. Le traitement L-NAME n'améliorait pas les dommages intestinaux et augmentait la mortalité.

Ces résultats semblent indiquer que NO synthétisé par iNOS joue un rôle pathogénique chez les animaux présentant une NEC induite et que l'inhibition de iNOS améliore les altérations inflammatoires dans l'intestin.

Resumen

El óxido nítrico (NO) generado por la sintasa del óxido nítrico inducible (iNOS) puede contribuir a la patogenia del daño intestinal local en la mucosa intestinal inflamada de la enteritis necrotizante (NEC).

Con el fin de estudiar la importancia del iNOS en la patogenia de la NEC, hemos estudiado los efectos de los inhibidores selectivos (aminoguanidina, AG) y no selectivo (L-nitro-arginina-metil-ester, L-NAME) de la iNOS sobre los cambios morfológicos intestinales en ratas neonatales con NEC experimental.

Las ratas neonatales fueron divididas en 5 grupos randomizados. El grupo control fue alimentado con leche materna. El grupo NEC consistió en animales separados de su madre y alimentados por gavaje con leche especial de roedor con el fin de inducir NEC. Las ratas en los grupos Sham, AG y L-NAME, fueron alimentadas de la misma manera y fueron tratadas además con salino al 0,9 %, AG a 10 ml/Kg/día y L-NAME a 10 mg/Kg/día respectivamente. Las ratas se sacrificaron en el 4º día y se recogieron los últimos 4 cm para estudios morfológicos y detección de niveles de nitrito y nitrato en el tejido.

Los animales de los grupos Sham y NEC mostraron varios grados de cambios inflamatorios intestinales y niveles aumentados de nitrito y nitrato en comparación con los del grupo control. Los tratamientos con AG y L-NAME redujeron los niveles tisulares de estos óxidos de nitrógeno pero los cambios inflamatorios del intestino solamente se atenuaron en los animales tratados con AG. El tratamiento con L-NAME no mejoró el daño intestinal y aumentó la mortalidad.

Estos resultados pueden indicar que el NO sintetizado por iNOS juega un papel patogénico en la NEC inducida por lactancia artificial y que la inhibición de INOS mejora el daño inflamatorio intestinal.

Zusammenfassung

In der entzündeten Darmmukosa bei nekrotisierender Enterokolitis wird Nitrinoxyd (NO) durch die Nitridoxydase (INOS) produziert. Nitritoxyd könnte jedoch zur Pathogenese der lokalen Schädigung bei NEC beitragen. Um die Bedeutung der Nitritoxydase im Hinblick auf die Pathogenese der NEC zu untersuchen und die Effekte der selektiven und nicht selektiven Gabe von Nitritoxydase-Blocker (selektiv Aminoguanidine AG, nicht selektiv L-Nitroarginine Methylester, L-NAME) zu studieren, wurde eine experimentelle NEC bei neugeborenen Ratten erzeugt.

Methodik: Die neugeborenen Ratten wurden in 5 Behandlungsgruppen unterteilt. Die Kontrollgruppe bestand aus Tieren, die brustgenährt wurden ohne Behandlung. Die NEC-Gruppe bestand aus neugeborenen Ratten, die von ihren Müttern getrennt wurden und eine spezielle Nagetiernahrung, welche NEC verursacht, erhielten. Hier wurden folgende Untergruppen gebildet: scheinbehandelte Ratten, Ratten, die mit AG (Aminoguanidine) und Ratten, die mit L-NAME (L-Nitroarginine Methylester) behandelt wurden. Alle erhielten die gleiche Ernährung wie die Tiere in der NEC-Gruppe insgesamt. Die zusätzlich verabreichten Medikamente bestanden in der scheinbehandelten Gruppe aus physiologischer Kochsalzlösung, in der AG-Gruppe aus 10 mg/kg/Tag Aminoguanidine und in der L-NAME-Gruppe in 10 mg/kg/Tag L-Nitroarginine Methylester. Am 4. Tag nach Behandlungsbeginn wurden die Tiere getötet und die letzten 4 cm des terminalen Ileums morphologisch untersucht, insbesondere im Hinblick auf Nitrit- und Nitratspiegel im Gewebe.

Schlussfolgerungen: Die Tiere in der NEC-Gruppe und der scheinbehandelten Gruppe zeigten ein unterschiedliches Ausmaß intestinaler Entzündung und im Hinblick auf die Kontrollgruppe erhöhte Spiegel von Nitrit und Nitrat im Gewebe. Bei beiden behandelten Gruppen, sowohl bei der AG wie bei der L-NAME-Gruppe waren jedoch die Nitritoxydspiegel verringert, die Entzündungszeichen waren jedoch nur bei den AG-behandelten Tieren vermindert, während die Gabe von L-NAME keine günstigeren Verläufe bzgl. intestinaler Schädigung und verringerter Mortalität aufwies.

Aus den Tierversuchen kann geschlossen werden, dass die Synthese von Nitritoxyd, induziert durch die Nitritoxydase eine pathologische Relevanz bei der Entstehung der NEC hat. Das Krankheitsbild kann durch eine spezielle Ernährungsform bei Ratten induziert werden. Die Hemmung der Nitritoxydase - am besten durch Aminoguanidine - kann das Risko entzündlicher Veränderungen verringern.

Key words

Necrotizing enterocolitis - nitric oxide - aminoguanidine - l-nitroarginine methyl ester

Mots-clés

Entérocolite nécrosante - oxyde nitrique - aminoguanidine - l-nitroarginine methyl ester

Palabras clave

Enteritis necrotizante - oxido nítrico - aminoguanidina - metil-ester de L-nitroarginina

Schlüsselwörter

Nekrotisierende Enterokolitis - Nitritoxydase - Aminoguanidine-Behandlung - L-Nitroarginine-Methylester-Therapie

References

• 1 Amin H J, Zamora S A, McMillan D D, Fick G H, Butzner J D, Parsons H G, Scott R B. Arginine supplementation prevents necrotizing enterocolitis in the premature infant.  J Pediatr. 2002;  140 425-431
• 2 Barlow B, Santulli T V, Heird W C, Pitt J, Blanc W A, Schullinger J N. An experimental study of acute neonatal enterocolitis - The importance of breast milk.  J Pediatr Surg. 1974;  9 587-595
• 3 Becker R M, Wu G, Galanko J A, Chen W, Maynor A R, Bose C L, Rhoads J M. Reduced serum amino acid concentrations in infants with necrotizing enterocolitis.  J Pediatr. 2000;  137 785-793
• 4 Di Lorenzo M, Bass J, Krantis A. Use of L-arginine in the treatment of experimental necrotizing enterocolitis.  J Pediatr Surg. 1995;  30 235-240
• 5 Ford H, Watkins S, Reblock K, Rowe M I. The role of inflammatory cytokines and nitric oxide in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis.  J Pediatr Surg. 1997;  32 275-282
• 6 Graf J L, VanderWall K J, Adzick N S, Harrison M R. Nitroglycerin attenuates the bowel damage of necrotizing enterocolitis in a rabbit model.  J Pediatr Surg. 1997;  32 283-285
• 7 Levi R, Burke J, Guo Z G, Hattori Y, Hoppens C M, McManus L M, Hanahan D J, Pinckard R N. Acetyl glyceryl ether phosphorylcholine (AGEPC): a putative mediator of cardiac anaphylaxis in guinea pig.  Circ Res. 1984;  54 117-124
• 8 Loeb A, Longnecker D. Inhibition of endothelium derived relaxing factor-dependent circulatory control in intact rats.  AM J Physiol. 1992;  262 H1494-1500
• 9 Moncada S, Palmer R MJ, Higgs E A. Nitric oxide: physiology, pathophysiology and pharmacology.  Pharmacol Rev. 1991;  43 109-141
• 10 Moshage H, Kok B, Huizenga J R, Jansen P L. Nitrite and nitrate determinations in plasma: A critical evaluation.  Clin Chem. 1995;  41 892-896
• 11 Nadler E P, Dickinson E, Knisely A, Zhang X R, Boyle P, Beer-Stolz D, Watkins S C, Ford H R. Expression of inducible nitric oxide synthase and interleukin-12 in experimental necrotizing enterocolitis.  J Surg Res. 2000;  92 71-77
• 12 Nadler E P, Stanford A, Zhang X, Schall L C, Alber S M, Watkins S C, Ford H R. Intestinal cytokine gene expression in infants with acute necrotizing enterocolitis: Interleukin-11 mRNA expression inversely correlates with extent of disease.  J Pediatr Surg. 2001;  36 1122-1129
• 13 Radi R, Beckman T W, Bush K M, Freeman B A. Peroxynitrite oxidation of sulfhydryls.  J Biol Chem. 1991;  266 4244-4250
• 14 Takano H, Yoshikawa T, Yamaguchi T, Hongo H, Fujii T, Boku Y, Yoshida N, Yamamoto H, Nakahashi Y, Yanagisawa R, Kondo M. Effects of aminoguanidine on systemic inflammatory response syndrome induced by platelet activating factor and by lipopolysaccharide in rats.  Eur J Pharmacol. 1997;  323 107-110
• 15 Tepperman B L, Brown J F, Whittle B J. Nitric oxide synthase induction and intestinal epithelial cell viability in rats.  Am J Physiol. 1993;  265 G214-218
• 16 Timmermans J P, Barbiers M, Scheuermann D W, Adriaensen D, Mayer B, De Groodt-Lasseel M H. Nitric oxide synthase immunoreactivity in the enteric nervous system of developing human digestive tract.  Cell Tissue Res. 1994;  275 235-245
• 17 Whittle B JR. Nitric oxide in physiology and pathology.  Histochem J. 1995;  27 727-737
• 18 Zamora S A, Amin H J, McMillan D D, Kubes P, Fick G H, Butzner J D, Parsons H G, Scott R B. Plasma L-arginine concentrations in premature infants with necrotizing enterocolitis.  J Pediatr. 1997;  131 226-232