Ki-67 Antisense-Therapie in murinen Nierenzellkarzinom-Modellen

Zusammenfassung

Fragestellung: Das Ki-67-Antigen wird nur in proliferierenden Zellen exprimiert. In vorausgegangenen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass gegen das Ki-67-Antigen gerichtete Antisense Oligonukleotide (asON) die Tumorzellproliferation und das Tumorwachstum in vitro und in subkutanen Harnblasen- und Prostatatumor-Modellen spezifisch hemmen können. In dieser Studie sollte die Effektivität dieses therapeutischen Ansatzes in 2 Nierenzelltumor-Modellen evaluiert werden. Material und Methode: Humane Nierenkarzinom (NZK)-Zellen (SK-RC 35) wurden zunächst mit FITC-markierten ON und verschiedenen kationischen Lipiden transfiziert, um die Transfektionseffizienz durchflusszytometrisch (FACS) zu bestimmen. Durch quantitative RT-PCR wurde die Potenz von 14 verschiedenen ON-Sequenzen gegen das Ki-67-Antigen in vitro verglichen. Der Einfluss des effektivsten Konstrukts auf die Zellproliferation wurde in Monolayer-Zellkultur durch Zellzählung ermittelt. Für In-vivo-Versuche wurden asON als auch Kontroll-ON im orthotopen immunkompetenten NZK-Modell (RENCA) bei Balb/c-Mäusen sowie im immundefizienten NZK-SCID-Mausmodell intraperitoneal appliziert. Tumorgrößen wie auch abschließende Tumorgewichte wurden dokumentiert. Überdies wurden verschiedene immunhistochemische Färbungen durchgeführt. Ergebnisse: FACS-Messungen zeigen hoch effektive Transfektionsbedingungen in vitro. Sowohl in RENCA- als auch SK-RC 35-Zellkultur bewirkten asON eine deutliche Proliferationshemmung. Die systemische Gabe von asON führte zu einer signifikanten Tumorwachstumshemmung sowohl im RENCA-Modell (p < 0,05) als auch im SCID-Mausmodell (p = 0,009). Immunhistochemische Färbungen der Tumoren zeigten eine deutliche Zielprotein-Hemmung wie auch eine gering erhöhte Apoptoserate nach Antisense-Behandlung, während die Gefäßdichte nicht signifikant beeinträchtigt wurde. Schlussfolgerung: Diese Ergebnisse demonstrieren, dass das Ki-67-Antigen ein geeignetes antiproliferatives Target ist und dass Antisense-Oligonukleotide gegen dieses Target einen potenten Wirkstoff darstellen, der eine signifikante Wachstumshemmung bei Nierenzelltumoren in unterschiedlichen Mausmodellen induziert.

Abstract

Purpose: The Ki-67 antigen is only expressed in proliferating cells. Previously, it was shown that Ki-67 derived antisense oligonucleotides (asONs) specifically inhibit the proliferation of tumor cells and tumour growth in vitro and in subcutaneous bladder and prostate tumor models. We intended to evaluate the effects of this therapeutic concept in two renal cell carcinoma (RCC) models. Material and Methods: Human RCC cells (SK-RC 35) were initially transfected with FITC-labeled ONs and diffferent cationic lipids to analyze the transfection efficacy by flow cytometry (FACS). The potency of 14 different ONs sequences was compared by quantitative RT-PCR in vitro. For in vivo testing, ONs were administered to immunocompetent Balb/c mice bearing orthotopic RENCA tumors as well as to SCID mice bearing subcutaneous RCC SK-RC 35 xenografts. Tumor sizes and final tumor weights were documented. Additionally, several immunohistochemical staining procedures were performed. Results: FACS analysis showed highly effective transfection conditions in vitro. Systemic administration of asONs significantly decreased the tumour growth in the RENCA model (p < 0.05) and in the SCID mouse model (p = 0.009). Immunohistochemical staining of tumor specimens revealed a marked down-regulation of target protein and a slight increase in apoptotic cells after antisense treatment while the microvessel count was not significantly altered. Conclusion: These results demonstrate that the Ki-67 antigen represents a suitable antiproliferative target and that asONs directed against this target are potent drugs that induce a significant inhibition of renal tumor growth in different mouse models.

Antisense - Oligonukleotide - Ki-67 - Proliferation - Nierenzellkarzinom

Antisense - oligonucleotides - Ki-67 - proliferation - renal cell carcinoma

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