Abstract
Background: Chromosomal translocations t(11;22) (q24;q12) are characteristic of about 80-90 % of Ewing's sarcoma family of tumors [bone and soft tissue Ewing's sarcoma and peripheral neuroectodermal tumors (PNET)]. They generate ews/fli1 rearrangements showing great diversity in breakpoint exon combination. In about 5 % of Ewing's tumors, ews is fused to the erg gene at 21q22. The various chimeric proteins encoded may function as aberrant oncogenic transcription factors. These specific translocations can be used for exact molecular diagnosis in these poorly differentiated small round-cell tumors. Moreover, the prognostic relevance of different translocational variants has been previously suggested. Furthermore, the sensitive molecular detection of minimal metastatic and residual disease and its clinical significance can be evaluated. To address these questions more definitively in the large number of patients registered in multicenter studies, it is often necessary to access archival paraffin-embedded tumor tissue if no fresh or frozen tumor material is available for analysis by RT (reverse transcription)-PCR. Specific problems arise from formalin-fixed and paraffin-embedded tissue due to the degradation of RNA and insufficient extraction efficiency. Therefore, primer distance and product size are limited for successful PCR amplification. This conflicts with the requirement for identification of various possible exon combinations by PCR simultaneously using one single primer pair with larger distance.Patients: We examined paraffin embedded soft part tumor tissue samples from 47 Ewing's tumor patients. Patients were treated according to either CWS (Cooperative Weichteilsarkomstudie, CWS-91 or CWS-96) or Euro-E.W.I.N.G. 99 therapy protocols. Method: We established a novel RT-PCR method, using 3 different exon specific sets of PCR primer pairs, selected according to the coding ews and fli1 nucleotide sequences (NCBI database), suitable for RT-PCR identification of variant ews/fli1 fusion transcripts in RNA isolated from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. For use in combination with ews -primer, an erg specific primer was selected to alternatively test for ews/erg fusion transcripts. As positive control for the integrity of isolated mRNA, we used the ubiquitously expressed gapdh transcript for RT-PCR amplification in each sample. Results: In 31 cases (= 66 %) of 47 paraffin samples of Ewing's tumors analysed, gapdh control indicated adequate quality of RNA. In 16 cases no gapdh control fragment was amplifiable, nevertheless in 2 of these 16 samples distinct ews fusion products could be detected. In 23 cases we identified ews fusion transcripts. Thereof in 65 % ews exon 7 being fused to fli1 exon 6 (fusion type I), in 22 % to fli1 exon 5 (fusion type II). In 4 % each ews exon 10 being juxtaposed to fli1 either exon 6 or exon 5, respectively. An ews/erg fusion was detected in 4 % (ews exon 7 fused to erg exon 6). In 10 samples, a gapdh fragment was amplified, but no ews/fli1 or -erg fusion transcript could be identified. The reference pathological review (I. L., Kiel, Germany) disproved the primary histopathology in 5 cases. Conclusions: Using our different sets of exon specific primer pairs, it was possible to detect 4 different breakpoints of ews/fli1 fusion transcripts and the ews/erg fusion by RT-PCR in RNA isolates from formalin-fixed, paraffin-embedded Ewing's tumor tissue. This method can be a very useful alternative in clinical situations (to ensure diagnosis and perform minimal metastatic and residual disease investigations) and in order to assess prognostic significance of translocation subtypes when no fresh tumor tissue is available.
Zusammenfassung
Hintergrund: Chromosomale Translokationen t(11;22) (q24; q12) sind für 80 bis 90 % der Familie der Ewing Tumoren [ossäre und extraossäre Ewing-Sarkome, periphere neuroektodermale Tumoren (PNET)] charakteristisch. Die ews/fli1 -Rearrangements zeigen in ihren Bruchpunkten große Diversität. Bei etwa 5 % der Ewing-Tumoren ist das ews -Gen alternativ mit erg auf 21q22 fusioniert. Die codierten chimären Proteine können als veränderte onkogene Transkriptionsfaktoren wirken. Zur exakten molekulargenetischen Diagnose dieser schwach differenzierten klein-rundzelligen Tumorgruppe können die spezifischen Translokationen genutzt werden. Darüber hinaus kommt den verschiedenen Translokationsvarianten möglicherweise eine prognostische Bedeutung zu. Außerdem können die Translokationsmarker zum hoch sensitiven Nachweis von Tumorzellen bei minimal metastatischer und residueller Tumorerkrankung genutzt und somit deren prognostische Bedeutung untersucht werden. Zur Bearbeitung dieser Fragestellungen bei einer großen Patientenzahl, die in multizentrischen Studien registriert sind, ist es notwendig, auf archiviertes, in Paraffin eingebettetes Material zurückzugreifen, wenn kein frisches oder gefrorenes Tumorgewebe für die Untersuchung mittels RT(reverse Transkription)-PCR zur Verfügung steht. Eine besondere Problematik ergibt sich aufgrund der Degradierung von RNA und der geringeren Extraktionseffizienz aus Formalin-fixiertem, in Paraffin eingebettetem Gewebe. Aus diesem Grund sind PCR-Primerdistanz und -Produktgröße limitiert. Dies steht im Widerspruch dazu, dass die simultane Identifikation unterschiedlicher Exon-Kombinationen eine größere PCR-Primerdistanz erfordert. Patienten: In Paraffin eingebettetes Weichteiltumorgewebe von 47 Ewing-Tumor-Patienten wurde untersucht. Die Therapie erfolgte entweder entsprechend dem CWS-(Cooperative Weichteilsarkomstudie, CWS-91 oder CWS-96) oder dem Euro-E.W.I.N.G 99-Protokoll. Methode: Unter Verwendung dreier verschiedener Exon-spezifischer Primerpaare, die entsprechend der codierenden Nukleotidsequenz für ews und fli1 ausgewählt wurden (NCBI-Datenbank), konnte eine neue RT-PCR-Methode zur Identifizierung unterschiedlicher ews/fli1 -Fusionstranskripte an RNA-Isolaten aus Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten Tumorproben etabliert werden. Für den alternativen Nachweis von ews/erg -Fusionen wurde ein entsprechender erg -Primer ausgewählt. Als Qualitätskontrolle für die isolierte mRNA wurde der RT-PCR-Nachweis des ubiquitär exprimierten gapdh -Gens eingesetzt. Ergebnisse: Von den 47 untersuchten Paraffin-Proben der Ewing-Tumoren zeigte die gapdh -Kontrolle in 31 Fällen (66 %) eine ausreichende Qualität der isolierten RNA. In 16 Fällen konnte kein gapdh -Fragment amplifiziert werden. Trotzdem war bei zwei dieser 16 gapdh -negativen Proben die Amplifikation eines ews -Fusionstranskriptes möglich. In 10 Fällen konnte ein gapdh -Fragment amplifiziert, aber kein ews/fli1 - oder erg -Fusionstranskript nachgewiesen werden. In der referenzpathologischen Beurteilung (I. L., Kiel, Germany) konnte in 5 dieser 10 Fälle die ursprüngliche histopathologische Diagnose (Ewing-Tumor) nicht bestätigt werden. Insgesamt in 23 Fällen konnten ews -Fusionstranskripte nachgewiesen werden. Davon war in 65 % das ews Exon 7 fusioniert mit fli1 -Exon 6 (Fusionstyp I), in 22 % mit fli1 -Exon 5 (Fusionstyp II). In je 4 % war ews -Exon 10 mit fli1 entweder Exon 6 oder Exon 5 fusioniert. Eine ews/erg -Fusion wurde in 4 % nachgewiesen (ews -Exon 7 fusioniert mit erg -Exon 6). Schlussfolgerung: Mit den ausgewählten Exon-spezifischen Primer-Paaren war es möglich, an RNA-Isolaten aus Formalin-fixiertem, in Paraffin eingebettetem Ewing-Tumorgewebe, vier unterschiedliche Bruchpunkte bei ews/fli1 -Fusionstranskripten und eine ews/erg -Fusion mittels RT-PCR nachzuweisen. Die hier beschriebene Methode kann eine nützliche Alternative darstellen, wenn kein frisches Tumorgewebe zur Verfügung steht. Dies gilt sowohl zur Beurteilung verschiedener klinischer Situationen (Absicherung der Diagnose, Nachweis von minimal metastatischer und residueller Erkrankung), als auch zur Bewertung der prognostischen Signifikanz unterschiedlicher Fusionstypen.
Key words
Ewing's sarcoma family of tumors - fusion transcript - paraffin embedded tissue - RT-PCR - soft tissue sarcoma
Schlüsselwörter
Ewing-Tumor-Familie - Fusionstranskript - Paraffin - RT-PCR - Weichteilsarkom
WAF1/CIP1 as adirect target of EWS-Fli1 oncogenic fusion protein.
J Biol Chem.
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2 terminus with BARD1 links the Ewing's sarcoma gene to a common tumor suppressor pathway.
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4583-4587
s.stegmaier@olgahospital.de
