Klonierungsfreie Reamplifikation differentiell exprimierter mRNA-Fragmente aus Kopf-Hals-Karzinomen *

Zusammenfassung

Hintergrund: Die Genexpression gesunder und maligner Zellen kann mit der “differential display” (DD) Technik verglichen werden. Im Rahmen des DD wird in der überwiegenden Zahl der Untersuchungen die Sequenzanalyse von differentiell exprimierten Genen nach einer zweiten PCR und einer Klonierung zur Erhöhung der DNA-Menge durchgeführt. Ziel dieser Untersuchung an Plattenepithelkarzinomzellen der Kopf-Hals-Region war es zu prüfen, ob eine ausreichende Menge an DNA für die Sequenzierung differentiell exprimierter DNA-Fragmente ohne Klonierungsschritte allein durch Modifikation der PCR-Bedingungen synthetisiert werden kann. Material und Methode: Nach mRNA-Extraktion aus kultivierten Keratinozyten und Plattenepithelkarzinomzellen des oberen Aerodigestivtraktes wurde diese mittels reverser Transkription in cDNA umgeschrieben und mit Hilfe der PCR amplifiziert. Differentiell exprimierte Fragmente wurden nach elektrophoretischer Analyse aus dem Gel isoliert und in einer zweiten PCR reamplifiziert. Eine weitere PCR mit dem Endprodukt der zweiten PCR als Matrize führte regelmäßig zu keiner verwertbaren DNA-Menge. Daraufhin wurde eine dritte PCR mit Verdünnungen von 1 : 10 bis 1 : 10¹⁰ des zweiten PCR-Produktes als Matrize durchgeführt. Ergebnisse: Es konnte eine für die Sequenzierung ausreichende Menge des differentiell exprimierten Fragmentes in einer dritten PCR erzielt werden, wenn Verdünnungen des zweiten PCR-Produktes von 1:10²-1:10⁷ als Matrize eingesetzt wurden. Schlußfolgerung: Modifikationen der PCR-Bedingungen erlauben die Gewinnung einer zur direkten Sequenzierung ausreichenden Zahl von cDNA-Kopien von differentiell exprimierten mRNA-Fragmenten aus Plattenepithelkarzinomzellen des oberen Aerodigestivtraktes. So können arbeitsintensive und hohe Sicherheitsstandards fordernde Klonierungsschritte vermieden werden.

Summary

Background: mRNA expression of healthy and malignant cells can be compared to each other by employing the “differential display” (DD) technique. Most studies describe sequence analysis of differentially expressed fragments after reamplification by a second round of PCR and subsequent molecular cloning to gain a sufficient amount of DNA for sequencing. The aim of this study was to show whether a sufficient amount of differentially expressed mRNA of squamous cell carcinoma cells of the head and neck region can be generated by PCR alone without cloning steps. Material and Methods: mRNA isolated from cultivated keratinocytes and squamous cell carcinoma cells was reverse transcribed into cDNA which was amplified with PCR. Differentially expressed fragments detected after gel electrophoresis were isolated from the gel and reamplified in a second PCR. The resulting cDNA amounts of the second PCR were suitable for cloning but not for direct sequencing. A third round of PCR with the undiluted final product of the second PCR as template regularly failed. Dilutions of the second PCR products between 1:10 and 1:10¹⁰ were prepared. The third round of PCR was carried out with these various template concentrations. Results: A sufficient amount of differentially expressed fragments for sequencing procedures resulted when dilutions of the second PCR products ranging from 1:10² to 1:10⁷ were used as templates in the third round of PCR. Conclusion: Modifications of PCR parameters provide high DNA copy numbers of differentially expressed mRNA fragments from squamous cell carcinoma cells of the upper aerodigestive tract in amounts that are needed for sequence analysis. This may make it possible to avoid labor-intensive cloning procedures requiring high safety standards.

Plattenepithelkarzinome - Keratinozyten - Reamplifikation - Differential display

Squamous cell Carcinoma - Keratinocytes - Reamplification - Differential display