Untersuchungen zur Reproduzierbarkeit einer nichtradioaktiven DDRT-PCR-Methode zum Nachweis der Genexpression in Plattenepithelkarzinomzellen der oberen Luft-und Speisewege

Zusammenfassung

Hintergrund: Die Analyse des Genspektrums von Tumor- und Normalzellen kann Informationen zur Expression von Genen geben, die zur Entstehung oder Differenzierung von Malignomen führen können. Die Differential Display Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (DDRT-PCR) ist eine innovative, schnell durchzuführende Methode zur Analyse von nahezu allen mRNA-Molekülen, die in der Zelle exprimiert werden. Methode: Es wurde die mRNA aus Keratinozyten, Mundboden- und Larynxkarzinomzellen mit dem Enzym Reverse Transkriptase in cDNA umgeschrieben. Die cDNA-Mole-küle wurden mit einer Vielzahl von Oligonukleotiden in der PCR hochamplifiziert und die entstehenden Produkte nachfolgend elektrophoretisch aufgetrennt. Zum Nachweis von PCR-Produkten mit Silbernitrat wurde ein modifiziertes Protokoll für die Amplifikation der cDNA-Proben erstellt. Ergebnisse: Nach reverser Transkription der mRNAs konnten alle cDNA-Proben mit Hilfe des für die Silbernitrat-DDRT-PCR erstellten Arbeitsprotokolls amplifiziert und die differentiell exprimierten Fragmente reproduzierbar nachgewiesen werden. Schlußfolgerungen: Durch die Reproduzierbarkeit und schnelle Durchführbarkeit der Silbernitrat-DDRT-PCR-Methode erweitern sich die Möglichkeiten zur Analyse der Genexpression und zum Nachweis differentiell exprimierter Gene in unterschiedlichen Arten von Zellen und so auch in Plattenepithelkarzinomzellen der oberen Luft- und Speisewege.

Summary

Background: The analysis of the gene spectrum in tumor and normal cells may provide information about genes involved in the differentiation or in the genesis of tumors. Differential Display Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (DDRT-PCR) is an innovative method that enables quick analysis of almost all mRNA molecules expressed in the cells. Methods: In the trials, the mRNAs of keratinocytes and tumor cells were amplified by a number of oligonucleotide pairs after reverse transcription and resolved on polyacrylamide gel. A modified protocol for the amplification of cDNA probes was devised for detecting PCR products with silver nitrate. Results: After reverse transcription of mRNAs, all cDNA samples were successfully amplified using the protocol devised for the silver nitrate DDRT-PCR, and the differentially expressed fragments were reproducibly demonstrated. Conclusions: The high reproducibility and feasibility of silver nitrate DDRT-PCR expand the alternatives for analyzing gene expression and detecting selectively expressed genes in different kinds of cells.

Schlüsselwörter

Plattenepithelkarzinom - Oberer Aerodige-stivtrakt - Genexpression - Silberfärbung - DDRT-PCR

Key words

Squamous cell carcinoma - Upper aerodigestive tract - Gene expression - Silverstaining - DDRT-PCR