Kultivierung humaner Keratinozyten der Schleimhaut des oberen Aerodigestivtraktes

Zusammenfassung

Hintergrund: Die Kultivierung benigner Zellen unter standardisierten Bedingungen ist in vielen Bereichen der Grundlagenforschung sowie in klinischen Gebieten von großer Bedeutung. Es wurde eine modifizierte einfache und schnelle Methode zur Etablierung von Keratinozyten unter Berücksichtigung des komplexen Umgebungsmilieus im Bereich der oberen Luft- und Speisewege erarbeitet. Methoden: Es wurde Schleimhaut aus dem oberen Aerodigestivtrakt untersucht, die im Rahmen von diagnostischen und therapeutischen Eingriffen bei 15 Patienten im Alter von 4-73 Jahren entnommen wurde. Die Abtrennung des Epithels von den darunterge-legenen Schleimhautschichten erfolgte durch Inkubation der Biopsate in Dispase über 12 h. Hieran schloß sich eine Trypsin-behandlung mit anschließender Disaggregation des Epithels in eine hoch angereicherte fibroblastenfreie Suspension von Keratinozyten (ca. 2 × 10⁶ Zellen/Biopsie) an. Die Keratinozyten wurden vor Aussaat der Zellen in unbehandelte Kulturflaschen mehrmals in frischem fetalen Kälberserum gewaschen. Die Kultivierung der Keratinozyten erfolgte in serumfreiem Medium, angereichert mit Epidermalem Wachstumsfaktor, Rinderhypophysenextrakt, Amphotericin B und Penicillin/Streptomycin. Ergebnisse: Es konnten mittlere Anheftungsraten von 60% in Primärkulturen und von 85% in Subkulturen erzielt werden. Die Keratinozyten erreichten zur Subkultivierung eine ausreichende Konfluenz in 10-13 Tagen und blieben maximal über 8 Passagen (120 Tage Lebensspanne) in Kultur. Während der Kultivierungsdauer zeigten die Keratinozyten lichtmikroskopisch die typische epitheliale Morphologie. Schlußfolgerungen: Das vorgestellte Kultivierungsprotokoll für Keratinozyten aus dem oberen Aerodigestivtrakt ermöglicht mit der modifizierten Art der Vorbehandlung eine schnelle und einfache Kultivierung epithelialer Zellen.

Summary

Background: Cultivation of benign epithelial cells under standardized conditions is of major interest in many fields of clinical and basic research. A modified fast and simple method for isolation, growth and passage of epidermal cells has been developed with consideration given to the complex environment of the upper aerodigestive tract. Methods: Normal human mucosa of the upper aerodigestive tract was taken from 15 patients (4-73 years) during diagnostic and therapeutic operations. The epithelium could be seperated easily from the mucosa after incubation the biopsies in dispase over night. Subsequently, keratinocytes were isolated enzymatically by dissociation of epidermal sheets in trypsin, resulting a suspension of highly proliferating keratinocytes without contaminating fibroblasts (2 × 10⁶ keratinocytes/biopsy). The cells were washed several times in fresh fetal calf serum before they were plated in untreated culture flasks. The keratinocytes were cultivated in serumfree medium supplemented with epidermal growth factor, bovine pituitary extract, amphotericin B, and penicillin/streptomycin. Results: An average plating efficiency of 60% in primary cultures and 85% in subcultures was obtained. Passaging was possible every 10-13 days when keratinocytes reached sufficient confluency. The cells could be subcultured up to eight times (lifespan of 120 days), and exhibited the typical epithelial morphology during cultivation. Conclusion: Because of the modified pretreatment of the keratinocytes before plating, this culturing protocol for keratinocytes derived from the upper aerodigestive tract enables easy and fast cultivation of keratinocytes, further simplifying currently available methods.

Schlüsselwörter

Keratinozyt - Obere Luft- und Speisewege - in vitro - Dispase-Behandlung - Zellselektion

Key words

Keratinocyte - Upper aerodigestiv tract - In vitro cultivation - Dispase-treatment - Cellseparation