Biophysikalische Grundlagen der Kollagenvernetzung

Zusammenfassung

Hintergrund: Die verringerte mechanische Stabilität der Hornhaut beim Keratokonus oder bei der iatrogenen Keratektasie nach Lasik kann durch photooxidative Vernetzung des Kollagens kompensiert werden. Für die sichere und effektive Anwendung dieser neuen Therapiemethode sollen die biophysikalischen Grundlagen zusammengestellt werden. Methode: Die Wahl der Therapieparameter soll anhand der Absorptionsverhältnisse in der Hornhaut erläutert werden. Die Sicherheit der Methode wird für das Endothel und für die Linse diskutiert. Die erzeugten Vernetzungen werden indirekt am Beispiel der dadurch veränderten physikochemischen Eigenschaften der Hornhaut aufgezeigt. Ergebnisse: Um eine hohe Absorption der Strahlungsenergie in der Hornhaut zu erreichen, wurden Riboflavin mit einer Konzentration von 0,1 % und UV-Licht der Wellenlänge von 370 nm entsprechend dem relativen Maximum der Absorption von Riboflavin gewählt. Eine Bestrahlungsstärke von 3 mW/cm² und eine Bestrahlungszeit von 30 min führen zu einer signifikanten Verfestigung. Durch die hohe Absorption innerhalb der Hornhaut wird das Endothel geschützt, d. h., bei einer Stromadicke größer 400 µm wird die Schädigungsschwelle des Endothels nicht erreicht. Als Nachweis der Vernetzungen gelten die Erhöhung der mechanischen Festigkeit, die Erhöhung der Resistenz gegen enzymatische Abbauprozesse, die geringere Quellungsneigung, eine erhöhte Schrumpfungstemperatur und ein vergrößerter Durchmesser der Kollagenfasern. Schlussfolgerung: Die Therapieparameter wurden experimentell getestet und haben sich klinisch bei der Kollagenvernetzung bewährt. Zum Erreichen eines sicheren Vernetzungseffektes ohne Schädigung umgebender Gewebe sollten diese Parameter eingehalten werden.

Abstract

Background: The reduced mechanical stability of the cornea in keratoconus or in keratectasia after Lasik may be increased by photooxidative cross-linking of corneal collagen. The biophysical principles are compiled for the safe and effective application of this new treatment method. Methods: The setting of the therapy parameters should be elucidated from the absorption behaviour of the cornea. The safety of the method for the endothelium cells and the lense will be discussed. The induced cross-links are shown to be the result of changes in the physico-chemical properties of the cornea. Results: To reach a high absorption of the irradiation energy in the cornea, riboflavin of a concentration of 0.1 % and UV light of a wavelength of 370 nm, corresponding to the relative maximum of absorption of riboflavin, were used. An irradiance of 3 mW/cm² and an irradiation time of 30 min lead to an increase of the mechanical stiffness. The endothelium cells will be protected due to the high absorption within the cornea, that means the damaging threshold of the endothelium cells will not be reached in a 400 µm thick stroma. As evidence for cross-links we can consider the increase of the biomechanical stiffness, the increased resistance against enzymatic degradation, a higher shrinkage temperature, a lower swelling rate and an increased diameter of collagen fibres. Conclusions: The therapy parameters were tested experimentally and have been proven clincally in the corneal collagen cross-linking. These parameters should be respected to reach a safe cross-linking effect without damage of the adjacent tissues.

Schlüsselwörter

Kornea - Keratokonus - Biomechanik - Vernetzung - ultraviolette Strahlung - Riboflavin

Key words

cornea - keratoconus - biomechanics - cross-linking - ultraviolet irradiation - riboflavin

Literatur

• 1 Aeschlimann D, Paulsson M. Cross-linking of laminin-nidogen complexes by tissue transglutaminase.  J Biol Chem. 1991;  266 15 308-15 317
• 2 Ahearne M, Yang Y, Then K Y. et al . Non-destructive mechanical characterization of UVA/riboflavin crosslinked collagen hydrogels.  Br J Ophthalmol. 2008 (im Druck); 
• 3 Asaga H, Kikuchi S, Yoshizato K. Collagen gel contraction by fibroblasts requires cellular fibronectin but not plasma fibronectin.  Exp Cell Res. 1991;  193 167-174
• 4 Ayala M N, Michael R, Söderberg P G. Influence of exposure time for UV radiation induced cataract.  Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000;  41 3539-3543
• 5 Andreassen T T, Simonsen A H, Oxlund H. Biomechanical properties of keratoconus and normal corneas.  Exp Eye Res. 1980;  31 435-441
• 6 Balasubramanian D, Kanwar R. Molecular pathology of dityrosine cross-links in proteins: structural and functional analysis of four proteins.  Mol Cell Biochmistry. 2002;  234 / 235 27-38
• 7 Cannon J. Collagen crosslinking in keratoconus.  Invest Ophthalmol Vis Sci. 1978;  17 63-65
• 8 Chan B P, So K F. Photochemical crosslinking improves the physicochemical properties of collagen scaffolds.  J Biomedical Material Res A. 2005;  75 689-701
• 9 Chen R N, Ho H O, Sheu M T. Characterization of collagen matrices crosslinked using microbial transglutaminase.  Biomaterials. 2005;  26 4229-4235
• 10 Doillon C J, Watsky M A, Hakim M. et al . A collagen-based scaffold for a tissue engineered human cornea: physical and physiological properties.  Int J Artifical Organs. 2003;  26 764-773
• 11 Dong X, Söderberg P, Ayaly M. et al . The effect of exposure time on maximum acceptable dose for avoidance of ultraviolet radiation-induced cataract.  Ophthalmic Res. 2005;  37 197-201
• 12 Ehlers N, Hjortdal J Ä, Funding M. et al . Modification of properties of corneal stroma by molecular cross-linking.  Ophthalmic Res. 2003;  35 S17
• 13 Ehlers N, Hjortdal J. Riboflavin-ultraviolet light induced cross-linking in endothelial decompensation.  Acta Ophthalmologica Scandinavica. 2008 (in Druck); 
• 14 Elsheikh A, Wang D, Brown M. et al . Assessment of corneal biomechanical properties and their variation with age.  Curr Eye Res. 2007;  32 11-19
• 15 Elstner E F. Der Sauerstoff. Biochemie, Biologie, Medizin. Mannheim, Leipzig, Wien, Zürich; BI-Wiss.-Verlag 1990: 40, 288
• 16 Guidry C, Grinnell F. Contraction of hydrated collagen gels by fibroblasts: evidence for two mechanisms by which collagen fibrils are stabilized.  Coll Relat Res. 1987;  6 515-529
• 17 Hafezi F, Kanellopoulos J, Wiltfang R. et al . Corneal collagen crosslinking with riboflavin and ultraviolet A to treat induced keratectasia after laser in situ keratomileusis.  J Cataract Refract Surg. 2007;  33 2035-2040
• 18 Huang R, Choe E, Min D B. Kinetics for singlet oxygen formation by riboflavin photosensitization and the reaction between riboflavin and singlet oxygen.  Journal Food Science. 2004;  69 726-732
• 19 Ihme A, Krieg T, Müller R K. et al . Biochemical investigation of cells from keratoconus and normal cornea.  Exp Eye Res. 1983;  36 625-631
• 20 Kagan H M, Trackman P C. Properties and function of lysyl oxidase.  American J Respiratory Cell Mol Biology. 1991;  5 206-210
• 21 Kato Y, Uchida K, Kawakishi S. Aggregation of collagen exposed to UVA in the presence of riboflavin: a plausible role of tyrosine modification.  Photochemisty Photobiology. 1994;  59 343-349
• 22 Kennedy C, Bastiaens M T, Bajdik C D. et al . Effect of smoking and sun on the aging skin.  J Invest Dermatol. 2003;  120 548-554
• 23 Kohlhaas M, Spoerl E, Speck A. et al . Eine neue Behandlung der Keratektasie nach LASIK durch Kollagenvernetzung mit Riboflavin/UVA-Licht.  Klin Monatsbl Augenheilkunde. 2005;  222 430-436
• 24 Kohlhaas M, Spoerl E, Schilde T. et al . Biomechanical evidence of the distribution of cross-links in corneas treated with riboflavin and ultraviolet A light.  J Cataract Refr Surg. 2006;  32 279-283
• 25 Kuo I C, Broman A, Pirouzmanesh M. et al . Is there an association between diabetes and keratoconus?.  Ophthalmology. 2006;  113 184-90
• 26 Li X, Rabinowitz Y S, Tang Y G. et al . Two-stage genome-wide linkage scan in keratoconus sib pair families.  Invest Ophthalmol Vis Sci. 2006;  47 3791-3795
• 27 Mackiewicz Z, Määttä M, Stenman M. et al . Collagenolytic proteinases in keratoconus.  Cornea. 2006;  25 603-610
• 28 Madhukumar E, Vijayammal P. Influence of cigarette smoke on cross-linking of dermal collagen.  Indian J Exp Biol. 1997;  35 483-486
• 29 Mäki J M, Sormunen R, Lippo S. et al . Lysyl oxidase is essential for normal development and function of the respiratory system and for the integrity of elastic and collagen fibers in various tissues.  Am J Pathol. 2005;  167 927-936
• 30 Mencucci R, Mazzotta C, Rossi F. et al . Riboflavin and ultraviolet A collagen crosslinking: In vivo thermographic analysis of the corneal surface.  J Cataract Refract Surg. 2007;  33 1005-1008
• 31 Netto M V, Mohan R R, Sinha S. et al . Stromal haze, myofibroblasts, and surface irregularity after PRK.  Exp Eye Res. 2006;  82 788-797
• 32 Orban J M, Wilson L B, Kofroth J A. Crosslinking of collagen gels by transglutaminase.  J Biomed Mater Res. 2004;  68A 756-762
• 33 Pflugfelder S C, Liu Z, Feuer W. et al . Corneal thickness indices discriminate between keratoconus and contact lens induced corneal thinning.  Ophthalmology. 2002;  109 2336-2341
• 34 Podskochy A. Protective role of corneal epithelium against ultraviolet radiation damage.  Acta Ophthalmol Scand. 2004;  82 714-717
• 35 Reichl S, Müller-Goymann C C. Entwicklung eines organotypischen Korneakonstrukts als ein In-vitro Modell für Permeationsstudien.  Ophthalmologe. 2001;  98 853-858
• 36 Schilde T, Kohlhaas M, Spoerl E. et al . Enzymatischer Nachweis der Tiefenabhängigkeit der Vernetzungswirkung von Riboflavin/UVA an der Hornhaut.  Ophthalmologe. 2007 (im Druck); 
• 37 Schreiber J. Verfestigung der Hornhaut durch UVA 365 nm und Riboflavin oder durch Glutaraldehyd. Dissertation. Dresden; TU Dresden 2003
• 38 Seiler T, Spoerl E, Huhle M. et al . Conservative therapy of keratoconus by enhancement of collagen cross-links.  Invest Ophthalmol Vis Sci. 1996;  37 S1017
• 39 Seiler T, Huhle S, Spörl E. et al . Manifest diabetes and keratoconus - a retrospective case-control study.  Graefe’s Arch Clin Exp Ophthalmol. 2000;  238 822-825
• 40 Semchishen V A, Mrochen M, Seminogov V N. et al . Light beam shaping and homogenization (LSBH) by irregular microlens structure for medical applications.  SPIE. 1998;  3251 28-33
• 41 Seppälä H P, Määttä M, Rautia M. et al . EMMPRIN and MMP-1 in keratoconus.  Cornea. 2006;  25 325-330
• 42 Sliney D, Aron-Rosa D, DeLori F. et al . Adjustment of guidelines for exposure of the eyr to optical radiation from ocular instruments: statement from a task group of the International Commission on Non-Ionizing Radiation Protection (ICNIRP).  Applied Optics. 2005;  44 2162-2176
• 43 Spörl E, Huhle M, Kasper M. et al . Erhöhung der Festigkeit der Hornhaut durch Vernetzung.  Der Ophthalmologe. 1997;  94 902-906
• 44 Spörl E, Huhle M, Seiler T. et al . The swelling behaviour of the cornea after artificial cross-linking.  Invest Ophthalmol Vis Sci. 1997;  38 S507
• 45 Spoerl E, Huhle M, Seiler T. Induction of cross-links in corneal tissue.  Exp Eye Res. 1998;  66 97-103
• 46 Spoerl E, Seiler T. Techniques for stiffening the cornea.  Refract Surg. 1999;  15 711-713
• 47 Spörl E, Schreiber J, Hellmund K. et al . Untersuchungen zur Verfestigung der Hornhaut am Kaninchen.  Der Ophthalmologe. 2000;  97 203-206
• 48 Spoerl E, Wollensak G, Dittert D D. et al . Thermomechanical behavior of collagen-crosslinked porcine cornea.  Ophthalmologica. 2004;  218 136-140
• 49 Spoerl E, Wollensak G, Reber F. et al . Crosslinking of human amniotic membrane by glutaraldehyde.  Ophthalmic Res. 2004;  36 71-77
• 50 Spoerl E, Wollensak G, Seiler T. Increased resistance of crosslinked cornea against enzymatic digestion.  Curr Eye Res. 2004;  29 35-40
• 51 Spoerl E, Mrochen M, Sliney D. et al . Safety of UVA-Riboflavin cross-linking of the cornea.  Cornea. 2007;  26 385-389
• 52 Uzawa K, Marshall M K, Katz E P. et al . Altered posttranslational modifications of collagen in keloid.  Biochem Biophys Res Commun. 1998;  249 652-655
• 53 Wollensak G, Spoerl E, Seiler T. Riboflavin/Ultraviolet - induced collagen crosslinking for the treatment of keratoconus.  Am J Ophthalmol. 2003;  135 620-624
• 54 Wollensak G, Spoerl E, Wilsch M. et al . Endothelial cell damage after riboflavin-ultraviolet-A-treatment in the rabbit.  J Cataract Ref Surg. 2003;  29 1786-1790
• 55 Wollensak G, Spoerl E, Seiler T. Stress-strain measurements of human and porcine cornea after riboflavin/ultravuolet-A-induced crosslinking.  J Cataract Refract Surg. 2003;  29 1780-1785
• 56 Wollensak G, Spoerl E, Wilsch M. et al . Keratocyte apoptosis after corneal collagen-crosslinking using riboflavin-UVA treatment.  Cornea. 2004;  23 43-49
• 57 Wollensak G, Wilsch M, Spoerl E. et al . Collagen fiber diameter in the rabbit cornea after collagen crosslinking by riboflavin/UVA.  Cornea. 2004;  23 503-507
• 58 Wollensak G, Aurich H, Pham D T. et al . Hydration behavior of porcine cornea crosslinked with riboflavin and ultraviolet A.  J Cataract Refract Surg. 2007;  33 516-521
• 59 Wollensak G, Iomdina E, Dittert D D. et al . Wound healing in the rabbit cornea after corneal collagen cross-linking with riboflavin and UVA.  Cornea. 2007;  26 600-605