Grundlagen der DNA-Diagnostik

Zusammenfassung

Bei einem ständig wachsenden Anteil der über 4000 heute bekannten monogenen Erbleiden können diagnostische Untersuchungen an der Erbsubstanz selbst (Desoxyribonukleinsäure=DNA) durchgeführt werden. Dabei ist die Mutation entweder direkt nachweisbar oder indirekt anhand des Musters von eng mit dem Gen gekoppelten DNA-Abschnitten auf dem gleichen Chromosom, sogenannten DNA-Polymorphismen. Dadurch kann festgestellt werden, ob ein Angehöriger in einer Familie mit einer Erbkrankheit Anlageträger ist oder nicht. Mit den gleichen Methoden läßt sich auch pränatal für mehr als 100 Krankheiten in einer Frühschwangerschaft aus Chorionbiopsien (8.-9. Woche) die Diagnose stellen oder ausschließen. Die Techniken der DNA-Diagnostik sind weitgehend standardisiert und für viele Krankheiten schon fast zur Routine geworden: Die gesamte DNA von 3 × 10⁹ Basenpaaren wird aus Zellen der zu untersuchenden Personen extrahiert und mit Restriktionsenzymen in kleinere Stücke von durchschnittlich 5 bis 20 Kilobasen „geschnitten”, dann denaturiert, d.h. einsträngig gemacht. Der uns interessierende DNA-Abschnitt (Gen, DNA-Marker) wird von einer ganz bestimmten, eigens hergestellten, markierten „Genprobe” erkannt, d.h. diese verbindet sich mit demjenigen Fragment der DNA, zu welchem sie über größere Abschnitte in ihrer Basenfolge „komplementär” ist. Im gleichen Arbeitsgang wird dabei mittels Elektrophorese auch die Länge des zu untersuchenden DNA-Abschnittes bestimmt. Diese Analysen können gleichzeitig für eine große Anzahl verschiedener Gen-Abschnitte aus einer sehr geringen Menge DNA mit hoher Präzision durchgeführt werden, ja sogar aus Spuren, denn heute kann man DNA mit der sogenannten Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in einer Zeit von wenigen Stunden um Faktoren von 10⁵ oder höher vervielfältigen. Am Beispiel von einigen relativ häufigen Erbkrankheiten, wie Muskeldystrophie Duchenne und Mukoviszidose werden diese Techniken erläutert und ihr präventiver Nutzeffekt für die genetische Beratung und Familienplanung, aber auch ihre zunehmende Inanspruchnahme durch die betroffenen Familienangehörigen diskutiert.

Summary

In an ever-increasing number of the more than 4000 known genetic diseases with Mendelian inheritance, the geneloci have been mapped. In such cases it is possible to predict by DNA techniques whether or not family members are carriers of the mutation and risk having affected children. Using the same methods, disease can also be predicted prenatally from chorionic villi biopsies (CVS) as early as the nineth week of pregnancy. With some diseases it is possible to analyze the DNA of the mutation directly, whereas in others closely linked polymorphic DNA markers have to be analyzed in order to distinguish the mutationbearing chromosome from the one with the normal allele. The techniques of diagnostic DNA investigations are now standard procedures in medical genetic laboratories and are performed almost routinely for many diseases: The total (genomic) DNA, with a length of 3 × 10⁹ base pairs (bp), is extracted from cells, mainly leukocytes from EDTA blood samples, then digested by restriction endonucleases into smaller fragments with a length of approx. 10³ to 10⁴ bp. The fragments are separated according to their lengths by agarose gel electrophoresis, then transferred to nitrocellulose („Southern Blot”) and made „single-stranded” by denaturation. The fragment in question can now be recognized by a specific gene probe with a homologous base sequence (hybridization). Since the probe is slightly radioactive, the hybridized genomic DNA fragment is recognized by autoradiography, and its length determined by the relative position it reached during electrophoresis. These analyses can be carried out simultaneously for different DNA fragments within and outside the gene locus. Since the genomic DNA can now be multiplied by a factor of approx. 10⁵ within a few hours by polymerase chain reaction (PCR) techniques, only very small amounts of material are needed, which is a great advantage for prenatal diagnosis from CVS. The application of these DNA techniques is illustrated by examples of diagnostic investigations in families with genetic diseases whose incidence is relatively high, such as cystic fibrosis or Duchenne type muscular dystrophy. Their usefulness in genetic counseling and the increasing demand for diagnostic DNA investigations by patient's relatives are discussed.