Eine neue objektivierte und validierte Methode zur Quantifizierung der Knochenneubildung in Tiermodellen auf Basis eines frei verfügbaren Bildbearbeitungsprogramms

Zusammenfassung

Studienziel: Die Quantifizierung neu gebildeten Knochens im experimentellen Knochendefektmodell ist ein häufiges Problem bei experimentellen Studien. Die meisten in der Literatur beschriebenen Methoden quantifizieren den Anteil des regenerierten Gewebes semiquantitativ, mithilfe eines Scoresystems. Dieses hängt oftmals stark von der Einschätzung des jeweiligen Untersuchers ab. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Einführung einer neuen Auswertemethode zur genauen Quantifizierung von Knochenregeneration anhand digitaler Röntgenbilder mithilfe einer frei verfügbaren Bildbearbeitungssoftware (GIMP, GNU General Public Licence) und deren Evaluation, bezogen auf die Parameter Objektivität und Reliabilität. Methoden: Die Auswertemethode umfasst 5 Schritte: Standardisierung der Bilder, Definition der „Region of Interest“ (ROI), Definition des „Interval of Interest“ (IOI), Pixelanalyse und Quantifizierung der Verknöcherung mittels Histogramm, ähnlich dem Houndsfield-Index. Um die Methode bezüglich der Objektivität und Reliabilität zu validieren, wurde sie mit 2 semiquantitativen Auswertemethoden verglichen. Dafür wurden 16 Röntgenbilder zweier verschiedener Tiermodelle (Radiusdefekt am Kaninchen [A] und Tibiadefekt am Schaf [B] von 6 Untersuchern bewertet. Zur Beurteilung der Reliabilität wurde die Auswertung nach 4 Wochen unter gleichen Bedingungen wiederholt. Ergebnisse: Die Objektivität war bei der Auswertung durch die neue Methode bei beiden Tiermodellen höher als bei den Kontrollmethoden. Als Maß wurde für jede Methode der Blant-Altman-Koeffizient gebildet (Modell A: GIMP: 0,095, Kontrolle 1: 0,272, Kontrolle 2: 0,283; Modell B: GIMP: 0,098, Kontrolle 1 : 0,658, Kontrolle 2: 0,668). Ähnliche Resultate wurden für die Reliabilität ermittelt (Modell A: GIMP: 0,086, Kontrolle 1: 0,221, Kontrolle 2: 0,385; Modell B: GIMP: 0,102, Kontrolle 1: 0,339, Kontrolle 2: 0,623). Schlussfolgerung: Die vorgestellte Quantifizierungsmethode hat sich als objektives und einfach zu bedienendes Werkzeug bei der Quantifizierung von Knochenneubildungen in 2 unterschiedlichen Tierexperimenten bewährt. Es zeichnet sich durch detaillierte und genaue Messergebnisse und eine hohe Objektivität und Reliabilität unabhängig vom Tiermodell aus.

Abstract

Aim: The quantification of newly formed bone in experimental defect models is a problem in various experimental set-ups. Several methods have been described to evaluate and quantify the regeneration of newly formed bone in various animal models. Most methods only describe the amount of regenerated tissue on a semi-quantitative level, the results significantly depend on the subjective rating of the observer and such evaluation methods have not been validated in terms of objectivity and reliability. The aim of the present study was to introduce a novel evaluation method for the accurate quantification of bone regeneration on digital X‐ray images using a freely available digital image software analysis programme (GIMP, GNU General Public Licence). Methods: The method introduced here contains 5 steps: standardisation of size and colour, determination of range of interest (ROI), defining different qualities of mineralisation, pixel analysis with histogram function, similar to the Hondsfield index, and quantification. In order to evaluate the objectivity and reliability, the quantification method was compared to semi-quantitative scores described by Mosheiff and Werntz for inter- and intraobserver variability. Six observers were asked to determine bone regeneration in 16 X‐ray images of 2 different animal models. In order to describe intraobserver variability, the evaluation was repeated after a period of 4 weeks. Statistical analysis including determination of intra- and interobserver variability (Bland-Altman coefficient of reproduction) was performed using SAS software. Results: For both experimental set-ups analysed in this project (rabbit and sheep bone defects), the objectivity was significantly higher in the GIMP-based evaluation compared to the evaluation according to Mosheiff and Werntz using the Bland-Altman coefficient (rabbit: GIMP: 0.095, Mosheiff: 0.272, Werntz: 0.283; sheep: GIMP: 0.098, Mosheiff: 0.658, Werntz: 0.668). Analogous results were obtained for reliability (rabbit: GIMP: 0.086, Mosheiff: 0.221, Werntz: 0.385; sheep: GIMP: 0.102, Mosheiff: 0.339, Werntz: 0.623). Conclusion: This quantification method introduced here has proved to be a reliable and “easy-to-use” tool in order to perform objective quantification of bone regeneration in 2 different experimental set-ups. It offers a more detailed and quantitative way for precise determination of regenerated tissue and is characterised by higher objectivity and reliability compared to other semi-quantitative evaluation methods. The objectivity seems to be independent of the animal model to which the method is applied.

Knochenregeneration - Knochendefekt - Tiermodelle - Tissue Engineering

bone regeneration - bone defect - bone quantification - animal model - tissue engineering

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