Einleitung
Einleitung
In den vergangenen Jahren wurden immer mehr Nahrungsmittelallergien
nachgewiesen, wobei als Allergene oft Proteine identifiziert wurden
[1]. Ein seit Jahrtausenden bekanntes Genuss- und
Nahrungsmittel ist Wein. Tatsächlich gibt es einige Fallstudien über
das Auftreten einer Weinallergie, die in der Regel mit schwerwiegenden
Symptomen einhergeht [2]
[3]
[4]
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
[11]
[12]
[13]
[14]
[15]
[16],
aber eine umfassende epidemiologische Untersuchung gibt es nicht.
Dabei werden auch Proteine als mögliche Allergene angenommen,
die in geringen Mengen im Wein vorkommen. Die Proteine gelangen vor allem
über die Traube in den Wein, können jedoch auch von Hefen und
Bakterien in den Wein freigesetzt werden [17]
[18]
[19].
Durch den Einsatz der Massenspektrometrie zur Identifizierung von
Proteinen wurden in den vergangenen fünf Jahren Erkenntnisse zur
Proteinzusammensetzung im Wein gewonnen [18]
[19]
[20]
[21]
[22]. Der Hauptanteil der
Weinproteine sind der Klasse der PR (Pathogenese-bezogenen)-Proteine
zuzuordnen, die in der Pflanze eine Abwehrfunktion ausüben und von der
Weinbeere in den Wein übergehen [16]
[17]
[18]
[19]
[20]
[21].
Eine erste Untersuchung zum allergenen Potenzial der Weinproteine
wurde von Pastorello et al. (2003) veröffentlicht. Sie konnten in der
Weinbeere drei Proteine identifizieren, die mögliche Allergene darstellen:
das Lipid-Transfer-Protein (LTP), ein Thaumatin-ähnliches Protein (TLP)
sowie eine Klasse 4-Endochitinase. In der gleichen Studie zeigten jedoch
Weinallergiker allergische Reaktionen nur gegenüber der Endochitinase nach
dem Konsum von jungem Rotwein [9]. Vassilopoulou et al.
(2007) hingegen konnten das Lipid-Transfer-Protein als Auslöser einer
Allergie gegenüber Weinbeeren bestätigen, während
Thaumatin-ähnliche Proteine und Endochitinasen kein allergenes Potenzial
besitzen [23]. Nach wie vor ist unklar, in welchem
Umfang welche Proteine aus dem Wein zum Auslösen einer klinischen Reaktion
führen können.
Das Lipid-Transfer-Protein ist ein bekanntes Nahrungsmittelallergen.
Insbesondere in den mediterranen Ländern ist es als Auslöser für
allergische Reaktionen auf Früchte der Rosaceen-Familie bekannt
[23]
[24]
[25]. So stellt das Lipid-Transfer-Protein das einzige in
der offiziellen Datenbank geführte Allergen der Weinbeere (Vitis Vinifera) dar [27].
Ziel unserer Untersuchungen ist die Aufreinigung sowie die
biochemische, biophysikalische und strukturelle Charakterisierung von
Weinproteinen. Damit bietet sich die Möglichkeit, mit den gereinigten
Weinproteinen die allergene Wirkung dieser Proteine zu testen.
Material und Methoden
Material und Methoden
Biochemische und strukturelle Charakterisierung der
Weinproteine
Weine: Die Weine wurden vom Weingut
Fleischer (Mainz) bezogen oder im Supermarkt erworben. Als Weißweine
wurden Riesling 2006, Sauvignon Blanc 2006 und Gewürztraminer 2006 (alle
aus Rheinhessen) eingesetzt und als Rotweine Portugieser 2005 aus der Pfalz
sowie Dornfelder 2007 aus Rheinhessen.
Konzentrierung der Proteine: Für die
Dialysen werden Spectra/Por®-Dialyseschläuche aus
regenerierter Cellulose mit einer Ausschlussgrenze von 3,5 kDa
verwendet. Die Dialysen erfolgen bei 4 ° C unter
ständigem Rühren für mindestens 72 Stunden gegen destilliertes
Wasser bei mindestens zweifachem Wechsel des Wassers pro Tag. Im Anschluss
werden die Weinproben im Rundkolben mittels Spin-Freezing in einem
Kältebad bei – 30 ° C gefroren, das
Trocknen findet bei einem Druck von 0,940 mbar über einen Zeitraum
von 24 Stunden statt.
Fällung mit Polyvinylpyrrolidon: Zur
Abtrennung der Polyphenole werden die lyophilisierten Weinproben mit PVP
(Polyclar® AT) gefällt. Hierfür werden 300 mg
der Weinprobe in 30 ml Puffer gelöst und mit 3 g PVP
versetzt.
Auftrennung mittels SDS-PAGE: Die
diskontinuierliche SDS-PAGE wird nach der Methode von Laemmli durchgeführt
[28]. Eingesetzt wird ein 3 %iges
Sammelgel und ein 12,5 oder 15 %iges Trenngel. Die Proteinproben
werden im Verhältnis 1 : 1 mit Denaturierungspuffer
(TRIS-Puffer mit 20 % [v/v] Glycerin, 10 % [v/v]
β-Mercaptoethanol, 4 % [w/v] SDS, Spatelspitze
Bromphenolblau) gemischt und nach einer zehnminütigen Denaturierung bei
95 ° C auf das Gel aufgetragen. Die Elektrophorese wird bei
120 V bei Raumtemperatur durchgeführt.
Aufreinigung mittels
Kationenaustauschchromatografie: Die Kationenaustauschchromatografie wird
mit einer UNO-S6-Säule (Bio-Rad) durchgeführt. Als Puffer wird
50 mM Zitratpuffer mit einem pH-Wert von 3,0 eingesetzt, eluiert wird
mit 1-molarem NaCl-Gradient.
Identifizierung: Die Identifizierung
erfolgt mittels LC-MS/MS am Institut für Immunologie der
Universitätsmedizin Mainz in der AG Schild durch Dr. Tenzer. Hierzu werden
die Coomassie-gefärbten Proteinbanden aus der SDS-PAGE ausgeschnitten und
mit Trypsin verdaut [18].
Ergebnisse
Ergebnisse
Biochemische und strukturelle Charakterisierung
Bei allen untersuchten Weinsorten (deutsche Rot- und
Weißweine) ist der Hauptanteil der Proteine den PR-Proteinen
(pathogenensis-related proteins) zuzuordnen, die sich im
Molekulargewichtsbereich von 10 bis 27 kDa befinden. Dies zeigt die
Gelelektrophorese am Beispiel von Portugieser Rotwein, Riesling, Sauvignon und
Gewürztraminer ([Abb. 1]).
Abb. 1 Coomassie-gefärbte SDS-PAGE
[12,5 %] deutscher Weine. 1 Molekulargewichtsmarker, 2
Portugieser Rotwein, 3 Riesling, 4 Sauvignon Blanc, 5 Gewürztraminer.
In einem Portugieser Rotwein konnte ein Lipid-Transfer-Protein
(Mr 11 kDa), Thaumatin-ähnliche Proteine (Mr
20 – 24 kDa sowie die Klasse-4-Endochitinase
(Mr 27 kDa) identifiziert werden [18].
Da das Lipid-Transfer-Protein als einziges Protein der Weinbeere als Allergen
in der offiziellen Allergendatenbank geführt wird, beschränkten wir
unsere folgenden Untersuchungen deshalb auf dieses Protein. Es ist vor allem im
Rotwein enthalten, da es in der Schale der Weinbeere vorkommt und somit bei der
Maischegärung in den Wein übergehen kann, während es bei der
Mostgärung des Weißweins vorher weitgehend mit dem Trester
abgetrennt wird.
Diese Überlegung zeigt sich auch bei der
gelelektrophoretischen Auftrennung der Weinproteine. Das Lipid-Transfer-Protein
mit einer molekularen Masse von etwa 11 kDa ist im Rotwein gut als Bande
zu erkennen, während es in den Weißweinen nicht zu erkennen ist ([Abb. 1]).
Auch in Dornfelder Rotweinen verschiedener Jahrgänge konnte
das LTP nachgewiesen werden. Deshalb setzten wir für die weitere
Charakterisierung exemplarisch Dornfelder Rotwein des Jahrgangs 2007 aus
Rheinhessen ein.
Aufreinigung des Lipid-Transfer-Proteins aus Rotwein
Aufreinigung des Lipid-Transfer-Proteins aus Rotwein
Da sich das Lipid-Transfer-Protein im Vergleich zu den anderen
Weinproteinen durch einen hohen (theoretischen) isoelektrischen Punkt von etwa
9 auszeichnet, wird zur Aufreinigung die Kationenaustauschchromatografie
eingesetzt. Das Chromatogramm zeigt, dass aus einem Dornfelder 2007 nach
Gefriertrocknung und PVP-Fällung verschiedene Proteine aufgereinigt
werden. Während zunächst die Thaumatin-ähnlichen Proteine
eluieren, wird als letztes Protein in einem kleinen Peak das LTP aufgereinigt
([Abb. 2]). Dies ist in der SDS-PAGE dokumentiert
und konnte durch eine massenspektrometrische Analyse bestätigt werden.
Abb. 2 Aufreinigung des LTP aus
Dornfelder mittels Kationenaustauschchromatografie. Eingesetzt wurde
dialysierter und gefriergetrockneter Dornfelder 2007 nach PVP-Fällung.
a Chromatogramm des Kationenaustauschs,
durchgeführt bei einem pH-Wert von 3,0. 1: Thaumatin-ähnliche
Proteine; 2: Lipid-Transfer-Protein; b Ausschnitt aus
a mit der Elution des Lipid-Transfer-Proteins;
c Coomassie-gefärbte SDS-PAGE
[15 %] mit den Fraktionen aus b.
Sequenz- und Strukturvergleich mit bekannten Allergenen
Sequenz- und Strukturvergleich mit bekannten Allergenen
Ein 3D-Modell des LTPs konnte mit bioinformatischen Methoden
erstellt werden. Als Grundlage diente das LTP aus Pfirsich (pru p 3), für
welches eine Struktur beschrieben ist. Dieses LTP und das aus der Weinbeere
(vit v 1, entspricht der Isoform 4) zeigen eine hohe Sequenzähnlichkeit
[28]. Somit konnte auf der Grundlage dieser Struktur mit
Kenntnis der Sequenz des LTP (Isoform 4) eine Struktur für das LTP aus dem
Wein erstellt werden. Dies erfolgte durch Homologie-Modellierung mithilfe von
Swiss Model [27]
[28]
[29]. Die Struktur ist in [Abb. 3 a] dargestellt.
Abb. 3 Proteinmodell des LTP
(Isoform 4) aus der Weinbeere. Erstellt mit Swiss Model und bearbeitet mit
Chimera. a Das Homologie-Modell des LTP. Die
stabilisierenden Disulfidbrücken sind in gelb eingezeichnet.
b Sequenzalignment des LTP aus der Weinbeere mit dem LTP
aus Pfirsich, erstellt mit ClustalX. Der hohe Grad an Sequenzidentität ist
im Vergleich der beiden Sequenzen zu erkennen; c Die
potenziellen Epitope des pru p 3 übertragen auf die Struktur des LTP aus
der Weinbeere. Aus Gründen der Übersichtlichkeit wurde die Struktur
um 90 ° gegenüber a gedreht.
Die Strukturen der verschiedenen Lipid-Transfer-Proteine sind sehr
ähnlich. Insbesondere die acht Cysteine, welche vier Disulfidbrücken
ausbilden, sind konserviert. Die hohe Sequenzähnlichkeit von
47 % (Identität) und 62 % (physiko-chemische
Ähnlichkeit) lässt nicht nur auf eine sehr ähnliche Struktur
([Abb. 3 b] und [3 c]) schließen. Tatsächlich gibt es drei
Bereiche auf der Proteinoberfläche des LTP, die als allergene
Determinanten diskutiert werden [32]. In einem dieser
Bereiche gibt es nur einen Aminosäureaustausch durch einen
isofunktionellen Seitenrest von Valin zu Isoleucin.
Diskussion
Diskussion
Unsere Untersuchungen zeigen, dass in den von uns untersuchten
deutschen Weinen tatsächlich potenzielle Allergene enthalten sind. Die
drei nachgewiesenen PR-Proteine werden deshalb als potenziell allergene
Proteine betrachtet, da sie drei Proteingruppen zugeordnet werden können,
die als Nahrungsmittelallergene bekannt sind ([Abb. 4]).
Abb. 4 Schematische Zuordnung
der drei nachgewiesenen PR-Proteine zu bekannten Nahrungsmittelallergenen.
Das Lipid-Transfer-Protein konnte bereits in einem Chardonnay Wein
aus Japan identifiziert werden [18]. Unsere
Untersuchungen weisen das Vorkommen des LTP auch in deutschen Rotweinen nach,
wobei entsprechende Untersuchungen aus anderen Weinregionen noch anstehen.
Lipid-Transfer-Proteine sind als Nahrungsmittelallergene vieler Pflanzen, auch
unter dem Begriff des LTP-Syndroms, bekannt und klinische Reaktionen treten vor
allem in den mediterranen Ländern auf [21]
[22]
[23]
[24]. Das LTP vit v 1 der
Weinbeere zeigt hohe Sequenzidentität zu dem Hauptallergen pru p 3 aus
Pfirsich. Zwischen diesen Proteinen wurden bereits Kreuzreaktionen beschrieben
[8]. Diese Ähnlichkeit lässt auch auf ein
ähnliches allergenes Verhalten schließen. Inwieweit das LTP aus dem
Wein als Allergen wirkt, muss allerdings durch klinische Versuche erst
bestätigt werden. Zudem bedarf es noch der Klärung, ob das LTP der
Weinbeere auch eine primäre Sensibilisierung hervorrufen kann,
d. h. auch unabhängig von einer Pfirsichallergie auftritt.
Für die klinischen Untersuchungen müssen die Proteine erst
aufgereinigt werden. Für das Lipid-Transfer-Protein konnten wir durch eine
PVP-Fällung mit anschließender Kationenaustauschchromatografie eine
Isolierung mit hoher Reinheit erreichen. Unserem Wissen nach ist dies die erste
Arbeit, die eine Isolierung des LTP aus Wein beschreibt. Unsere aktuellen
Untersuchungen konzentrieren sich auf die biophysikalische Charakterisierung
des LTPs, um auch zu klären, ob durch die Weinbereitung strukturelle
Änderungen hervorgerufen werden und damit die Induktion einer Allergie
ausbleibt und wenn, weshalb.
Wir möchten hier besonders betonen, dass nicht
ausschließlich rheinhessische bzw. deutsche Weine Proteine mit potenziell
allergenem Charakter enthalten, sondern alle von uns untersuchten Weine
[16]. Dies wird auch durch die Literatur bestätigt
[9]
[19]
[20]
[21]
[22]
[23]. Sollten unsere
Untersuchungen ergeben, dass die Weinproteine allergische Reaktionen
auslösen können, werden unsere Ergebnisse dazu beitragen, den Winzern
Hinweise zu geben, das an sich sichere Produkt Wein auch für Allergiker
noch sicherer zu machen.
Danksagung
Danksagung
Wir danken dem Weingut Fleischer aus Mainz für die freundliche
Überlassung der Weine und der AG Schild/Tenzer für die
Durchführung der massenspektrometrischen Analysen.
Die Untersuchungen werden von der Stiftung Rheinland-Pfalz für
Innovation und der Johannes Gutenberg-Universität Mainz
gefördert.
