Liquid Biopsy bei Lungenkarzinom-Patienten – Untersuchungen zur Standardisierung der Präanalytik

Einleitung:

Der spezifische und sensitive Nachweis zellfreier Nukleinsäuren im Plasma von Tumorpatienten hat in den letzten Jahren den Weg aus dem Labor in den klinischen Alltag gefunden. Bei Patienten mit einem Lungentumor ist die therapiebegleitende Untersuchung extrazellulärer Nukleinsäuren zum Nachweis einer Resistenzmutation gegen eingesetzte Tyrosinkinaseinhibitoren inzwischen etabliert. Trotzdem gibt es kein standardisiertes Verfahren zur Blutentnahme und zur Plasmapräparation. Ziel der vorliegenden Untersuchungen ist die Etablierung eines Standards für diese Schritte.

Material und Methoden:

Blut von Lungentumorpatienten wurde in EDTA Röhrchen und PAXgene ccfDNA tubes (Qiagen) abgenommen und sofort bzw. nach 7-tägiger Lagerung bei Raumtemperatur (RT) aufgearbeitet. Das Plasma wurde mittels einer 2-stufigen Zentrifugation gewonnen und bis zur DNA Isolation bei -80 °C gelagert. Die Plasma DNA wurde mittels real-time PCR quantifiziert.

Ergebnisse:

Die Menge an extrazellulärer Gesamt-DNA sowie an tumor-assoziierter DNA (gemessen mittels einer tumor-assoziierten methylierten Gensequenz) ist in beiden Abnahmeröhrchen vergleichbar wenn das Plasma am Tag der Blutentnahme präpariert wird. Nach 7-tägiger Lagerung nimmt die Menge an Gesamt DNA in den EDTA Röhrchen stark zu während sie in den ccfDNA tubes nahezu konstant bleibt. Das trifft auch auf die methylierte DNA zu. Der Einsatz von ccfDNA Röhrchen zum Therapiemonitoring von Lungentumorpatienten bestätigte unsere mit EDTA Blut erzielten Resultate.

Schlussfolgerung:

Im Gegensatz zu EDTA Blut ist die Lagerung von Proben in ccfDNA Röhrchen für 7 Tage bei RT möglich. Dabei wird die extrazelluläre DNA stabilisiert und es kommt zu keiner „Kontamination“ genomischer DNA durch die Lyse von Blutzellen. Die ccfDNA Röhrchen eignen sich zur Untersuchung unmodifizierter als auch methylierter DNA. Damit sind erste Voraussetzungen zur Etablierung einer „standard operating procedure (SOP)“ für die Blutabnahme und Plasmagewinnung geschaffen.