Atg16l1 koordiniert die Antwort auf DNA-Schäden im intestinalen Epithel

Einleitung:

Autophagie ist wichtig für den Abbau von cytoplasmatischen Makromolekülen. Für die Funktionalität dieses Pathways ist das CED-Risikogen ATG16L1 entscheidend. Auswirkungen von Mutationen dieses Gens auf DNA-Schäden sind aber weitestgehend unbekannt. Wir konnten in der Vergangenheit zeigen, dass die Defizienz des Enzyms RNase H2b zu gestörter Nukleotid-Exzisions-Reperatur und gehäuften Doppelstrang-Brüchen führt mit p53- abhängiger verminderter Proliferation der Stammzellen. Fehlten p53 und RNAseH2b führte dies zu intestinaler Karzinogenese.

Ziele:

Ziel war es, die Rolle von Atg16l1 in der Koordinierung der DNA-Reparatur zu untersuchen.

Methodik:

Als Standardmethoden haben wir Immunoblots und Expressionsanalysen benutzt.

Wir haben intestinale epitheliale ModeK Zellen mit siRNA gegen Atg16l1 transfiziert und zur Induktion von DNA-Schäden mit Cytarabin A (AraC) stimuliert. Den Zelltod in vitro haben wir per Durchflusszytometrie ermittelt. Aus Wildtyp, Atg16l1 ^dIEC, Rnaseh2b ^dIEC und Atg16l1/Rnaseh2b ^dIEC Mäusen haben wir intestinale Organoide erzeugt und für Zellwachstumssassays sowie RNA-Sequenzierung benutzt. Mit den Tiere wurden eine basale Phänotypisierung, Alterungsexperimente und akute sowie chronische DSS-Kolitiden durchgeführt. Post mortem haben wir Fluoreszenz- und Immun-Histochemie-Färbungen angefertigt.

Ergebnis:

Stimulation mit AraC führte zu Atg16l1-abhängiger Induktion von Autophagie. Fehlen von Atg16l1 führte zu einer Zunahme des AraC induzierten Zelltodes. In-vivo führte die zusätzliche Deletion von Atg16l1 in den Atg16l1/Rnaseh2b ^dIEC Tieren zum Anstieg von Zelltod und Entzündung im Vergleich zu den Rnaseh2b ^dIEC Tieren. Überraschend führte die Atg16l1- Deletion zu gesteigerter Stammzellproliferation. In-vitro konnten wir dies in Organoiden reproduzieren. Das Transkriptom zeigte eine Vielzahl an differentiell exprimierten Genen, z.B. die erhöhte Expression des Protoonkogens MET.

Schlussfolgerung:

Atg16l1 spielt eine wichtige Rolle in der Antwort der Zelle auf DNA-Schäden und beeinflusst das Zellüberleben, sowie die durch DNA-Schäden verminderte Proliferation von Stammzellen. Dies deutet daraufhin, dass Atg16l1 eine bisher unbekannte Rolle in der intestinalen Karzinogenese spielen könnte.