Análise de terminações nervosas no complexo labrum-bíceps superior usando imunohistoquímica de fluorescência e microscopia a laser confocal^[*]

Resumo

Objetivos As estruturas capsulo-ligamentares do ombro funcionam como estabilizadores estáticos, juntamente com os músculos do bíceps e do manguito rotador, aumentando a superfície de contato da cavidade glenoide. Terminações nervosas livres e mecanorreceptores foram identificados no ombro; no entanto, existem alguns estudos que descrevem a presença desses nervos na inserção do bíceps. Este estudo teve como objetivo descrever a morfologia e distribuição de terminações nervosas utilizando imunofluorescência com protein gene product 9.5 (PGP 9.5) e microscopia confocal.

Métodos Foram estudados seis complexos labrum-bíceps de seis cadáveres congelados frescos. Os espécimes foram cortados coronalmente e preparados pelo método de imunofluorescência. Tanto em hematoxilina e eosina (H&E) quanto em imunofluorescência, foi descrita a organização do tecido conjuntivo com fibras paralelas de colágeno.

Resultados No estudo de H&E, foram visualizadas estruturas vasculares e algumas estruturas nervosas, que foram identificadas pela presença alongada da célula nervosa. Todas as amostras analisadas com imunofluorescência e microscopia confocal demonstraram baixa ocorrência de morfotipos de corpúsculos sensoriais e terminações nervosas livres. Identificamos terminações nervosas livres localizadas no labrum, inserção bicipital e terminações nervosas esparsas ao longo do tendão. Terminais corpusculares com aspecto fusiforme, cuneiforme e oval foram identificados no tendão.

Conclusão Esses achados corroboram a hipótese de que a geração de dor nas lesões labrais superiores de anterior a posterior (SLAP, na sigla em inglês) deriva da parte mais proximal do cabo longo do bíceps e ainda mais do labrum superior. Estudos quantitativos futuros com um número maior de espécimes podem fornecer mais informações sobre esses sistemas sensoriais.

Palavras-chave

bíceps - técnica de anticorpos fluorescentes - labrum - mecanorreceptores - terminações nervosas - ombro

Introdução

O labrum superior da glenoide serve como local de fixação da inserção do tendão da cabeça longa dos bíceps, sendo assim suscetível à lesão produzida pelo seu descolamento da glenoide, de anterior a posterior, conhecida como lesão labral superior de anterior a posterior (SLAP, na sigla em inglês).[1] Andrews et al.[2] foi o primeiro a descrever lesões no labrum superior. Estas podem ser observadas com frequência em jovens atletas de “esportes de arremesso”, sendo secundárias a microlesões repetitivas.[3] Também pode ocorrer em associação com outras situações traumáticas, como deslocamento glenoumeral primário ou recorrente.[4] Clinicamente, observou-se que, após reparos anatômicos da SLAP, os pacientes apresentaram um período prolongado de dor, quando comparados aos submetidos aos procedimentos de liberação de bíceps.[5] [6] [7] O mecanismo fisiopatológico da dor, presente tanto na lesão quanto no reparo cirúrgico e na eventual falha do tratamento, tem sido envolvido na presença de nociceptores. Estudos histológicos do complexo labral demonstraram a presença de terminações nervosas livres e mecanorreceptores.[8] [9] Sintomas como dor, instabilidade e sensação de “travamento articular podem ser atribuídos ao enfraquecimento do reflexo proprioceptivo.[10] Embora os relatos de lesões por SLAP sejam frequentes na literatura, estudos recentes têm relatado um aumento considerável no número de reparos cirúrgicos dessas lesões na última década. [11] Atualmente, os avanços em marcadores de anticorpos específicos para terminações nervosas, associados à microscopia a laser confocal, permitem a visualização e detalhamento de estruturas nervosas com imagens tridimensionais.[12] [13] [14] O objetivo desta investigação foi avaliar histologicamente a porção média do complexo bíceps-labral superior. Nós imaginamos que a zona de transição entre o labrum e a cabeça longa do tendão do bíceps conteria terminações nervosas e vasos. Esperamos estabelecer um paralelo entre nossos achados e a fisiopatologia da SLAP e a tendinopatia da cabeça longa da do bíceps.

Métodos

Foram utilizados 6 complexos bíceps-labrais superiores (SLBCs, na sigla em inglês) de cadáveres humanos congelados (3 homens, 3 mulheres) com idades entre 20 e 70 anos. A aprovação deste projeto foi concedida e acompanhada por meio de nossa institucional pelo comitê de ética (n° 443.172). Utilizamos um marcador pan-neuronal seletivo, o protein gene product 9.5 (PGP 9.5) pan-axonal (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, EUA), para destacar a inervação sensorial. Os trechos foram lavados com solução tampão de fosfato frio de 0,1 M (PBS, Laborclin, Pinhais, PR, Brasil) contendo 3% Triton X-100 (TX-100, Inlab, Diadema, SP, Brasil). Os tecidos foram lavados e incubados em anticorpos primários por 2 horas; depois, o anticorpo secundário foi conjugado a uma tag fluorescente (Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG, Thermo Fisher Scientific Inc.). As seções foram lavadas, seladas e os slides foram armazenados a -70 °C. Todas as 36 seções dos espécimes foram examinadas com um sistema de microscópio de varredura a laser confocal (LSM710, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Alemanha). Usamos hematoxilina & eosina e a mancha tricromática de Masson nos espécimes de SLBC de porção média, e o nervo mediano serviu como controle de qualidade para imunofluorescência. Os resultados são expressos como meios e desvio padrão (DP). Os dados foram analisados usando o software GraphPad Prism (versão 6.0 para Windows, GraphPad Software, San Diego, Califórnia, EUA).

Resultados

A análise leve da microscopia das seções mostrou facilmente o tendão do bíceps com vasos sanguíneos escassos, espaçados, finos e ligeiramente ondulados ([Fig. 1, A] e [B]). Na parte de transição entre o bíceps e o labrum, pudemos observar estruturas complexas, com células também alongadas sugerindo células nervosas ([Fig. 2 A, B] e [C]).

Fig. 1 (A e B) Seção longitudinal e histológica (10 μm) manchada com hematoxilina e eosina. Observe os vasos sanguíneos (círculos) no tendão do bíceps.

Fig. 2 Terminações nervosas de tecido conjuntivo fusiformes e cônicas na zona de transição entre o labrum e o bíceps. Aumento de 50x (A), 100x (B) e 200x (C). Seção histológica longitudinal (10 μm) manchada com hematoxilina e eosina.

O microscópio confocal revelou terminações nervosas livres através da cabeça longa do tendão do bíceps, de 1 a 6 µm de comprimento, em paralelo aos feixes de colágeno dispostos, também dissociados da presença de vasos sanguíneos ([Fig. 3]). Na porção média do SLBC, identificamos fibras nervosas medindo entre 60 e 70 µm de diâmetro e ramificando-se em feixes nervosos menores ([Fig. 4]).

Fig. 3 Seção do tendão do bíceps (50 μm de espessura). Observe as terminações nervosas livres (setas) no tecido conjuntivo, analisadas pelo microscópio laser confocal (imunofluorescência, escala 50 μm).

Fig. 4 Zona de transição entre o labrum e o bíceps. Observe a fibra nervosa na camada profunda medindo entre 60 e 70 μm de diâmetro, bifurcando em feixes nervosos menores (imunofluorescência, escala de 50 μm).

Ademais, na porção média do SLBC, também se observou fibras nervosas de menor calibre, de 7 a 10 µm de diâmetro, próximas ao vaso, exibindo imunorreatividade periférica e intraluminal para PGP 9.5. Nos slides submetidos à técnica de recuperação antigênica, a presença de terminações nervosas complexas com dimensões variáveis, variando de 150 a 350 µm de comprimento e 80 a 100 µm de largura. Observou-se na face articular das amostras, ao lado da região labral e da transição labrum-bíceps, axônios entre 10 e 20 µm de espessura, e diferentes formatos espaciais, com predominância de formas de fuso, cônico e oval ([Fig. 5 A, B] e [C]).

Fig. 5 Terminações nervosas com formas diferentes, variando de 150 a 350 μm de comprimento por 80 a 100 μm de largura (técnica de recuperação antigênica, escala 50 μm).

Discussão

O conhecimento da neuroanatomia das estruturas estabilizadoras passivas do ombro ajuda a compreender os mecanismos proprioceptivos de proteção e estabilização articular. O tendão da cabeça longa do bíceps tem sido estudado como uma causa de dor na articulação glenoumeral, seja em tendinopatias.[15] Alpantaki et al.[16] foram os primeiros a estudar esses elementos neurais no tendão longo do bíceps, que descreveram como contendo uma grande rede de fibras e sensores nervosos simpáticos, não associados aos vasos sanguíneos, e com distribuição neural predominantemente próxima à sua inserção. Nossos achados foram parcialmente compatíveis com os relatados por Alpantaki et al. [16] Encontramos algumas fibras nervosas finas, seguindo seus próprios caminhos, isoladas dos vasos e dispersas ao longo da estrutura de fibra de colágeno. Observou-se também, proximalmente, fibras maiores na transição labrum-bíceps em torno de estruturas vasculares, como relatado por Boesmueller et al.,[17] que também demonstraram uma densidade de nervos no segmento proximal do tendão do bíceps longo, semelhante à porção anterior do labrum superior. De acordo com esses autores, observou-se a presença de estruturas neurais ocorrendo predominantemente na porção mais proximal do tendão do bíceps. Nas amostras submetidas à técnica de recuperação antigênica, observamos terminações nervosas complexas próximas à porção labral e à transição labrum-bicipital, que são predominantemente distribuídas nas camadas mais próximas da articulação glenoide, tornando-se possivelmente a primeira região a ser estimulada pelo contato com a cabeça umeral durante o movimento do ombro. Existem informações sobre a localização de estruturas neurais no labrum superior e âncora bicipital. Entre as descrições, Hashimoto et al.[18] apresentaram a presença isolada de terminações nervosas livres no labrum e transição capsular; segundo Vangsness et al.,[8] temos apenas terminações nervosas livres; Witherspoon et al.[9] descrevem apenas fascículos nervosos na periferia do labrum anteroinferior e posteroinferior. Em relação ao aspecto fisiopatológico da SLAP no ombro, parece evidente que o tendão bicipital atua como um potencial gerador de dor, tendo maior densidade de estruturas neurais (neurofilamentos) nas partes proximais, como observado em outros estudos.[17] [19] [20] Identificamos terminações nervosas nas três regiões (tendão do bíceps, transição labrum e bíceps, labrum superior) do complexo formado pelo labrum superior e pela inserção bicipital, com aspectos bem diferenciados. No segmento proximal do tendão do bíceps, encontramos terminações nervosas livres finas, sem associação com estruturas vasculares, e não foram identificadas terminações nervosas complexas. Na zona de transição entre o labrum e os bíceps, encontramos feixes nervosos espessos, acompanhando os vasos sanguíneos arteriais presentes nesta área. Na região labral e na transição labrum-bicipital, encontramos terminações nervosas complexas estruturas ovais, cônicas e fusiformes.[21] Há necessidade de novos estudos para confirmar nossos achados, bem como para identificar com precisão os mecanorreceptores, incluindo o teste de outros anticorpos e marcadores celulares, aumentando assim o número de indivíduos na amostra, buscando compreender todos os fatores relacionados à interação da biomecânica e ao sistema proprioceptivo do ombro. O presente estudo preliminar mostra a morfologia das terminações nervosas, assim como identifica com precisão os mecanorreceptores por imunofluorescência. No entanto, o número de espécimes e incluindo outros anticorpos e marcadores celulares, seria interessante comparar as condições anatômicas e patológicas.

Conclusão

Foram identificadas terminações nervosas nas três regiões (tendão do bíceps, transição labrum e bíceps, labrum superior) do complexo formado pelo labrum superior e pela inserção bicipital, com aspectos bem diferenciados. No segmento proximal do tendão do bíceps, encontramos terminações nervosas livres finas, sem associação com estruturas vasculares, e não foram identificadas terminações nervosas complexas. Na zona de transição entre o labrum e o bíceps, encontramos feixes nervosos espessos, acompanhando os vasos sanguíneos arteriais presentes nesta área. Na região labral e na transição labrum-bicipital, encontramos terminações nervosas complexas, sendo possível identificá-las em relação ao formato espacial, que consistiu em estruturas ovais, cônicas e fusiformes.

Conflito de Interesses

Os autores não têm conflito de interesses para declarar.

Contribuições dos autores

Eduardo G. Fernandes foi o responsável pela concepção, design, conteúdo intelectual e científico do estudo, aquisição e interpretação de dados e redação de manuscritos. M. L. C. Cavalcante foi responsável pela pesquisa, edição de manuscritos, interpretação dos dados e revisão crítica, e submissão do manuscrito. F. V. Jamacaru, E. G. Fernandes, J. V. V. Coelho e J. A. D. Leite estiveram envolvidos nos procedimentos técnicos.

Trabalho desenvolvido no Departamento de Ortopedia, Universidade Federal do Ceará, Hospital Universitário Walter Cantídio, Fortaleza, Ceará, Brasil.

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Publication History

Received: 01 June 2020

Accepted: 16 September 2020

Article published online:
13 August 2021