Was ist Plasma?
Der Begriff „Plasma“ hat in der Wissenschaft mehrere Bedeutungen. In der Biologie bezieht es sich auf das Karyo- oder Zytoplasma und in der Medizin auf das Blutplasma. In der Physik bezeichnet Plasma allerdings ein partiell oder komplett ionisiertes Gas, welches durch Energiezufuhr erzeugt wird. Da sich die physikalischen Eigenschaften des ionisierten Gasplasmas stark von den nicht-ionisierten Formen unterscheiden, wird Plasma auch als 4. Aggregatzustand der Materie ([Abb. 1]) bezeichnet.
Abb. 1 Die vier Aggregatzustände der Materie.
Physikalische Plasmen sind ein verbreitetes natürliches Phänomen, ca. 99 % aller sichtbaren Materie im Universum existiert im Plasmazustand. Entsprechend dem Druck, unter dem das Plasma entsteht, wird es als Niederdruck-, Atmosphären-/Normaldruck- oder Hochdruckplasma klassifiziert. Es kann weiterhin in kaltes und heißes Plasma unterteilt werden, abhängig von der Gastemperatur [1]. Die meisten natürlich auftretenden Plasmen sind heiß, wie z. B. Sterne oder Blitze. Die Aurora borealis ist ein Beispiel für ein in der Natur vorkommendes kaltes Plasma [1].
Plasmen können künstlich generiert werden. Die häufigsten eingesetzten Verfahren zur Gasdissoziation sind Elektrizität, Mikrowellenstrahlung oder Hitze [1]. Solche technischen Plasmen können unter verschiedenen Druckbedingungen gezündet werden. Niedrigdruckplasmen haben den Vorteil, dass sie nur geringe Mengen an Prozessgas benötigen. Allerdings ist teures Vakuumgerät erforderlich und die zu behandelnden Materialien müssen vakuumstabil sein. Normaldruckplasmen können unter Umgebungsbedingungen gezündet werden und benötigen kein zusätzliches Equipment [1]. Die Temperatur solcher Plasmen ist jedoch meist sehr hoch, z. B. mehrere tausend Grad beim Plasmaschweißen [2]. Wenn allerdings über technische Applikationen realisiert wird, dass der Auswurf des Normaldruckplasmas sehr schnell ist, befinden sich die Elektronen und schweren Partikel nicht im thermischen Gleichgewicht. In diesem Fall ist die Temperatur der schweren Partikel sehr viel niedriger als die der Elektronen und liegt nur noch zwischen 25 °C und 45 °C [3]. Diese Plasmen werden „kalte atmosphärische Plasmen“ (KAP oder CAP − cold atmospheric plasmas) genannt und können am Menschen zu medizinischen Zwecken eingesetzt werden [4].
Entwicklung der Plasmamedizin
Entwicklung der Plasmamedizin
Die Anwendung von Plasma am menschlichen Körper für medizinische Zwecke hat eine lange Tradition. Mitte des 19. Jahrhunderts wurde die Elektrotherapie als therapeutischer Ansatz eingeführt und Funken-/Blitzentladungen zur Behandlung verschiedener Erkrankungen eingesetzt [5]. Später wurden elektrochirurgische Techniken basierend auf Plasmaanwendungen entwickelt. Die Argon-Plasma-Koagulation (APC) ist eine gut etablierte Methode während der Endoskopie in Gastroenterologie, Allgemein- und Viszeralchirurgie, Urologie und Gynäkologie [6]. APC wurde in den 1970ern eingeführt und ist eine monopolare Technik, bei der die elektrische Energie durch Argonplasma auf das Zielgewebe überführt wird. Vergleichende Studien haben gezeigt, dass die APC effektiver als die traditionelle Laserablation ist. Eine weitere elektrochirurgische Praktik stellt der Plasmajet dar. Die Wirkung wird über thermale Interaktion auf das lebende Gewebe vermittelt. Der Jet besteht aus einem bipolaren Elektrodensystem mit Argon als Prozessgas. Diese Technik wird üblicherweise zum Schneiden oder Koagulieren von Gewebe eingesetzt. Diese direkten Plasmaanwendungen in der Elektrochirurgie basieren auf Interaktionen des Plasmas mit dem Gewebe, welche zur Denaturierung von Proteinen, zur Zerstörung von Zellen und zur lokalen Devitalisierung („Versiegeln“) von Gewebe führt [5]
[7].
Im letzten Jahrzehnt hat die Entwicklung von kalten Atmosphärendruckplasmen zu der Entstehung eines neuen Anwendungs- und Forschungsfeldes geführt, der Plasmamedizin [1]. In diesem Zweig der Medizin geht es um die Nutzung der Effekte von kalten, milden Plasmen, die für sensible Materialien eingesetzt werden, die nicht vakuum- oder hitzestabil sein müssen. Dies schließt Anwendungen am Menschen ebenso ein wie Anwendungen in der Nahrungsmittelindustrie (Früchte oder rohes Fleisch) [1]
[8]
[9]
[10]. „Kalt“ beschreibt in diesem Fall Temperaturen um 40 °C auf dem behandelten Substrat. Diese Temperaturen ermöglichen die schmerzfreie Behandlung von Geweben, z. B. in der Dermatologie [11]. Es besteht aber auch in anderen Disziplinen wie der Onkologie, Chirurgie, Hals-Nasen-Ohrenheilkunde, Gastroenterologie und Zahnheilkunde reges Interesse an der Anwendung von Plasma [5]. Hierbei will man sich die Interaktion von bestimmten Plasmakomponenten und den spezifischen strukturellen Elementen und Funktionen von lebenden Zellen zu Nutze machen [5]
[7], um diese Technik für verschiedene therapeutische Zwecke einzusetzen.
Direkte und indirekte nicht-thermische Plasmaquellen
Direkte und indirekte nicht-thermische Plasmaquellen
Zur Erzeugung von KAP werden generell drei Ansätze verfolgt, direkte und indirekte Quellen sowie Hybridsysteme [3]. Indirekte Plasmaquellen sind durch in sich geschlossene Systeme gekennzeichnet, wobei das Plasma in einem Hohlraum zwischen zwei Elektroden erzeugt wird [12]. Die aktiven Spezies werden anschließend mit dem Gasstrom transportiert [5]. Die behandelte Fläche kommt demnach nicht in direkten Kontakt mit dem Plasma, sondern nur mit dem Effluenten [12]. Verschiedene indirekte Plasmageräte sind erhältlich, von schmalen Plasmanadeln oder -jets zu größeren Plasmafackeln wie dem kINPen MED, dem Atmospheric Pressure MicroPlasma Jet (APMPJ) oder dem MicroPlaSter [5]. Im Gegensatz dazu wird bei den direkten Quellen das Plasma zwischen einer dielektrischen Barriereschicht an der Elektrode und der biologischen Probe, welche als Gegenelektrode dient, erzeugt. Dies resultiert in einem direkten Kontakt des Plasmas mit der behandelten Oberfläche [12]. Die am meisten genutzte Technologie für diese Kategorie sind die DBD- (dielectric barrier discharge) Quellen [5]. Plasmajet und DBD-Quelle teilen sich bestimmte Komponenten und Materialien ([Abb. 2]). Zusätzlich benötigt der Plasmajet ein Trägergas wie Helium oder Argon, während DBD-Quellen das Plasma direkt an Luft erzeugen können [3]. Bei einigen Anwendungen wurden Sauerstoff und Stickstoff beigefügt, um eine spezifische chemische Zusammensetzung des KAP zu erzeugen [3]. Durch den kontinuierlichen Fluss des Trägergases entsteht bei dem Plasmajet eine „Flamme“, währenddessen die DBD-Quelle ein kurzes aber breites Plasma liefert. Dementsprechend könnte der Plasmajet geeigneter für die Behandlung von kleinen Bereichen einer Probe sein, während die DBD-Quelle für die Behandlung von großen Flächen passender erscheint [3]. Hybridplasmaquellen kombinieren die Vorteile von direkten und indirekten Plasmaquellen, indem sie z. B. die Technik zur Plasmaerzeugung von der direkten Plasmaquelle zusammen mit den stromfreien Eigenschaften der indirekten Quellen nutzen ([Tab. 1]). Dies wird durch die Einführung einer geerdeten maschendrahtförmigen Elektrode möglich, die einen sehr viel geringeren elektrischen Widerstand als Gewebe hat. Auf diese Weise fließt der Strom durch das Drahtgeflecht anstatt den Körper [5].
Abb. 2 Aufbau und Hauptkomponenten von Plasmajet und DBD-Plasmaquelle.
Tab. 1
Merkmale direkter und indirekter Plasmaquellen sowie Hybridsysteme [11].
|
Direktes Plasma
|
Indirektes Plasma
|
„Hybrid“-Plasma
|
|
technische Beispiele
|
Dielektrische Berriereentladung (DBD)
|
Plasmanadel, Plasmajet
|
Stille Koronarentladung
|
|
Herstellung und Merkmale
|
Haut oder Gewebe dienen als Elektrode, Strom fließt durch den Körper
|
Plasmaproduktion zwischen zwei Elektroden, Transport über den Gasstrom zur Probe
|
Herstellung ähnlich der direkten Plasmen mit Merkmalen der indirekten Plasmen. Da als Gegenelektrode ein Drahtnetz mit geringem elektrischen Widerstand verwendet wird, fließt kein Strom durch den Körper.
|
|
Gas
|
Luft
|
Edelgase/ Luft
|
Luft
|
|
Abstand zwischen Gerät und Probe
|
~ mm
|
~ mm – cm
|
~ mm
|
|
reaktive Spezies
|
Produktion im Plasma
|
Produktion durch Mischung von Plasma und Luft
|
hauptsächlich Produktion im Plasma
|
|
UV Strahlung
|
relativ schwach
|
relativ stark
|
relativ schwach
|
|
Gastemperatur
|
~ Raumtemperatur
|
heiß am Produktionsort
|
~ Raumtemperatur
|
|
Plasmadichte an der Probe
|
hoch
|
niedrig
|
relativ hoch
|
Wirkung von KAPs auf Mikroorganismen und humane Zellen
Wirkung von KAPs auf Mikroorganismen und humane Zellen
KAPs sind elektrisch leitfähige, quasi-neutrale Gase und bestehen aus Elektronen, negativen und positiven Ionen, freien Radikalen, reaktiven Molekülen (z. B. Ozon und Wasserstoff) und Peroxiden sowie UV-Strahlung ([Abb. 3]). Fernerhin entstehen sichtbares Licht, Wärmestrahlung und elektromagnetische Strahlung [13]. Da die KAP-Quellen bei Umgebungsdruck im Kontakt mit Luft arbeiten, erzeugen sie außerdem große Mengen an reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffradikalen (ROS und RNS). Diese haben einen starken Einfluss auf die zelluläre Biochemie und sind wichtige Bestandteile des Immunsystems. Damit stellen sie wahrscheinlich Schlüsselpunkte in der Therapie mit KAP dar [5].
Abb. 3 Zusammensetzung von nicht-thermischen (kalten) Atmosphärendruckplasmen (KAPs).
Aus zahlreichen Studien unter Niederdruckbedingungen ist es bereits bekannt, dass Plasma genutzt werden kann, um Mikroorganismen abzutöten [1]. Nicht-thermische Atmosphärendruck-Plasmen sind in der Lage, ebenso effektiv Mikroorganismen zu inaktivieren [14]
[15]
[16]
[17]
[18]
[19]
[20]
[21]. Antibiotikaresistente pathogene Keime konnten erfolgreich mittels Plasma eliminiert werden [22]
[23]
[24]. Darüber hinaus können auch mikrobielle Biofilme entfernt werden [25]
[26]
[27]
[28]
[29]. Ebenso können Bakteriophagen und Viren [30]
[31] sowie Bakterien- und Pilzsporen abgetötet werden [32]
[33]. Dies führte zu der Hypothese, dass KAPs für die antiseptische Behandlung von infizierten chronischen Wunden geeignet sein oder zur Desinfektion von chirurgischen Instrumenten und Kathetern eingesetzt werden könnten [34].
Die Mikroorganismen werden bei der Behandlung mit KAPs vermutlich durch die auftretenden ROS und RNS, wie z. B. atomarer Sauerstoff, Ozon, Hydroxylradikale und Nitrit, abgetötet [1]
[8]. Es konnten sowohl Membran- als auch DNA-Schädigungen nachgewiesen werden [35]. UV-Strahlung, wie bei den Niederdruckplasmen, ist hier vermutlich nicht der ausschlaggebende Faktor, da nur wenige Photonen die Oberfläche durch die Luft erreichen [1]. Eine synergistische Wirkung von UV-Strahlung und reaktiven Spezies konnte jedoch in einem speziell hierfür angefertigten Plasmajet nachgewiesen werden [36]. Die bakterizide Wirkung war deutlich geringer, wenn nur die reaktiven Spezies oder nur die UV-Strahlung zu den Bakterien geleitet wurden im Vergleich zu der Behandlung mit dem kompletten Effluent des Helium-Sauerstoff-Plasmajets [36]. Die Anwesenheit von Photonen und reaktiven Spezies induziert vermutlich zusätzliche photochemische Reaktionen in dem Effluenten und aktiviert Sauerstoffmoleküle sowie protonierte Wasserkluster [37].
Für die Anwendung der KAPs zur Behandlung von Hautinfektionen ist allein eine mikrobiozide Wirkung nicht ausreichend; sie darf die anwesenden humanen Zellen auch nicht schädigen. In verschiedenen Studien wurden daher direkte und indirekte Plasmaquellen hinsichtlich des Einflusses auf eukaryontische Zellen untersucht. Ergebnisse zeigen, dass KAPs gut toleriert werden können, wenn die Behandlungszeit kurz gehalten wird [38]. Dennoch sind Plasmaeffekte auf verschiedenen Ebenen zu beobachten. Wie bei den Mikroorganismen ist die erste Zielstruktur die Zellmembran mit ihren Lipiden und eingebetteten Rezeptorproteinen und Enzymen. Lipidperoxidation und Modifikation der Zelladhäsionsmoleküle wurden beobachtet, die zu veränderter Zellmigration und Signalweiterleitung führten. Die reaktiven Moleküle erreichen die Zelle durch Diffusionsprozesse, aber sie können auch direkt in der Zelle induziert werden und so ihre Effekte auf z. B. Proteine ausüben. UV-Strahlung und freie Radikale können weiterhin die DNA beeinflussen und so zu Änderungen bei der Zellproliferation oder zur Induktion von Apoptose führen. Alle Effekte sind abhängig von der Plasmadosis/Behandlungszeit. Dementsprechend sind sowohl stimulierende als auch schädigende Effekte möglich [34]. So wurde z. B. beobachtet, dass die Behandlung mit KAP bei dem Einsatz von DBDs eukaryontische Zellen stimulieren kann und so zu schnellerer Zellproliferation und verstärkter Angiogenese führt, wodurch der Wundheilungsprozess verkürzt werden kann [1]. Zusätzlich wurde eine plasmaabhängige Aktivierung von Zytokinen und Wachstumsfaktoren berichtet [39]. In Versuchen mit Tumorzelllinien wurde dagegen gefunden, dass Krebszellen sehr viel sensitiver auf KAP reagieren als normale Zellen und KAP selektiv Apoptose bei diesen induzieren kann [5]
[40].
Wirkungen von KAPs sind stark von den Bedingungen abhängig, unter denen sie untersucht werden. Einige verwendete Zelllinien sind resistenter gegenüber der Plasmabehandlung, während bei anderen Zelltypen eine Induktion der Apoptose gefunden wurde [1]. Um den Einfluss von KAPs zu untersuchen, sollte daher der Empfehlung gefolgt werden, Zelllinien oder primäre Zellen zu verwenden, die der späteren Anwendung entsprechen [41]. Darüber hinaus sind die Behandlungsbedingungen zwischen den einzelnen Studien häufig sehr unterschiedlich und reichen von isolierten experimentellen Ansätzen auf Glas oder Agar über Hautmodelle zu Tierversuchen und klinischen Beobachtungen. Außerdem erfolgt die Anwendung von KAPs unter trockenen bis halbtrockenen Konditionen oder direkt in Flüssigkeiten. Bei Letzterem reagiert das Plasma zu großen Teilen mit der Flüssigkeit selbst und die entstehenden chemischen Produkte interagieren dann mit den Proben [1]. Können die Untersuchungen zur Interaktion von KAPs nicht in vivo (Tiermodelle/Patienten) durchgeführt werden, so werden passende In-vitro-Modelle benötigt ([Abb. 4]). Experimente können an einfachen Zellmonoschichten durchgeführt werden, wobei einerseits die erhöhte Sensitivität der Zellen unter diesen Bedingungen als auch die Interaktion des Plasmas mit dem Medium zu beachten ist. Ein höheres Maß an Komplexität kann durch den Einsatz von 3D-Hautmodellen mit einer ausdifferenzierten Epidermis und einer Fibroblasten enthaltenden dermalen Komponente erreicht werden. Wiegand et al. haben in einem solchen Modell einen Plasmajet (Tigres plasma MEF technology) und den Einfluss der Parameter Prozessgas, Eingangsleistung und Behandlungszeit untersucht [42]. Es konnte gezeigt werden, dass niedrige Plasmadosen eine gute Zellkompatibilität aufwiesen. Eine Erhöhung der Eingangsleistung und die Verlängerung der Behandlungszeit führten jedoch zu schädigenden Effekten in den 3D-Hautmodellen, erkennbar an Veränderungen in der Morphologie sowie der Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen. Es wurde außerdem beobachtet, dass Luft als Prozessgas einen stärkeren Effekt hatte als Stickstoff [42].
Abb. 4 Schematische Darstellung der Interaktion von KAPs in vitro und in vivo mit Zellen und Geweben. Das Hautmodell stellt einen Übergang zwischen der Testung auf Zellschichten und der komplexen Haut dar.
Klinische Anwendungen von KAPs
Klinische Anwendungen von KAPs
Klinische Anwendungen von KAPs reichen von Oberflächendekontamination zur Sterilisation von medizinischen Instrumenten über die Wundheilung sowie Hautdesinfektion und Infektionskontrolle zur Behandlung von entzündlichen Hauterkrankungen und bis zu onkologischen Anwendungen. Dabei steht die Nutzung der antimikrobiellen Eigenschaften von KAPs im Vordergrund.
Die Anwendung von KAPs in klinischen Bereichen zur Dekontamination sollte zahlreiche Vorteile gegenüber derzeit eingesetzten Verfahren wie z. B. Flüssigdesinfektion, H2O2, UV etc. haben. KAPs sind effektiv, sicher und umweltfreundlich [13]. Die niedrigen Arbeitstemperaturen ermöglichen die Behandlung unterschiedlichster Objekte unabhängig von deren Zusammensetzung, z. B. Textilien, Pager, Kugelschreiber und andere Gegenstände aus dem klinischen Alltag [13].
KAPs können sowohl durch den antiseptischen Effekt als auch durch die Stimulation der Proliferation und Migration von Hautzellen, die Aktivierung oder Inhibierung von Integrin-Rezeptoren auf den Zellen und die pro-angiogene Wirkung die Wundheilung beeinflussen [34]. In einer klinischen Studie mit Patienten zur Nutzung einer DBD-Plasmaquelle (PlasmaDerm VU-2010) als adjuvante Therapie bei chronisch-venösen Beinulzera konnte gezeigt werden, dass die Behandlung sicher ist, generell gut vertragen wird und effektiv die bakterielle Belastung reduzierte [43]. Vergleichbare Ergebnisse erzielte eine klinische Studie mit dem MicroPlaSter® an infizierten chronischen Wunden, bereits durch eine einmal tägliche KAP-Behandlung für 2 bis 5 min konnte die Bakterienzahl in den Wunden im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen signifikant reduziert werden [44]. Zusätzliche förderliche Effekte auf die Wundheilung wurden in einer Studie mit Patienten mit diabetischem Fußsyndrom und der Plasmaquelle „Plasmafon“ beobachtet. In der Gruppe mit KAP-Behandlung wurde ein schnellerer Wundverschluss und eine deutliche Schmerzreduktion innerhalb von 5 Tagen im Vergleich zu der unbehandelten Kontrollgruppe gefunden [11]. Dies ist vermutlich auf die Produktion von Stickstoffmonooxid (NO) zurückzuführen [11], welches vasodilatierend wirkt und so die Mikrozirkulation verbessern kann, direkte bakterizide Effekte aufweist und Fibroblasten sowie Endothelzellen über die Induktion von Zytokinen und Wachstumsfaktoren stimuliert [11]. Die erste randomisierte kontrollierte klinische Studie zu dem Effekt von KAP auf die Wundheilung untersucht die Anwendung bei standardisierten Wunden (Spalthautentnahmestellen). Deutliche Effekte bezüglich verbesserter Reepithelisierung sowie weniger Fibrinbeläge und Krustenbildung wurden beobachtet. Es trat darüber hinaus keine Wundinfektion auf [45].
KAPs sind nicht nur bei der Behandlung von chronischen Wunden ein neues innovatives Konzept, sondern könnten auch bei anderen Hauterkrankungen, bei denen bakterielle Superinfektionen eine wesentliche Rolle spielen, wie der atopischen Dermatits (AD), zur topischen Behandlung eingesetzt werden [11]
[34]. Um den Effekt von KAP auf die Kolonisation der Haut mit fakultativ pathogenen Mikroorganismen zu untersuchen, behandelten Daeschlein et al. einen Patienten mit ausgeprägter Staphylococcus aureus-Besiedelung für 3 min mit einem Plasmajet, was zu einer selektiven Eradikation dieses Pathogens führte, während die physiologische Flora mit Staphylococcus epidermidis und Staphylococcus haemolyticus intakt blieb [46]. Mertens et al. demonstrierten ebenso eine Reduktion von Staphylococcus aureus um das Zehnfache innerhalb von 2 Tagen bei einem Patienten mit AD bei Behandlung mit einer direkten DBD-Plasmaquelle. Darüber hinaus waren eine deutliche Verbesserung des Erythems und eine Reduktion des Pruritus zu beobachten [47].
KAPs können selektiv Apoptose in Tumorzellen induzieren [40]; daher könnte diese Technologie ein Potenzial in der onkologischen Therapie aufweisen oder zumindest konventionelle Therapien unterstützen [5]. Die Anwendung von KAPs in der onkologischen Therapie ist ein recht junges Forschungsgebiet. Bisher beschränkt sich die Forschung auf die Beschreibung von KAP-Effekten auf maligne Zellen in vitro und in vivo. Das Verständnis der Mechanismen ist jedoch noch limitiert und muss demnach noch weiter erforscht werden, um KAP als potenzielle Krebstherapie zu etablieren [3]. Bekannt ist, dass die Wirksamkeit von KAPs dosisabhängig und antiproportional zu der Wachstumsgeschwindigkeit der malignen Zellen ist. Untersuchungen zu den Effekten von KAP auf Zelladhäsion, Migration und Invasionskapazität haben gezeigt, dass KAP-Behandlung die Zelladhäsion verringern kann ohne Nekrose auszulösen [5]. Yan et al. stellten fest, dass viele Schlüsselfragen jedoch noch offen sind [3]. Woher kommt die Selektivität der KAP-Behandlung für maligne Zellen und was sind die genauen zellulären und molekularen Antworten von malignen bzw. normalen Zellen? Gibt es Unterschiede in der Sensitivität gengenüber KAP bei den verschiedenen Krebstypen? Gibt es generelle zelluläre oder molekulare Marker, um die Selektivität zu beschreiben? Wenn die Unterscheidungsmechanismen bekannt sind, kann dieses Wissen genutzt werden, um die Selektivität von KAP durch Kontrolle der Erzeugung spezifischer Spezies in dem KAP-Effluenten zu erhöhen? Was sind die potenziellen toxischen Effekte von KAPs? Was ist der Vorteil der KAP-Behandlung gegenüber existierenden Therapieoptionen? Um diese Fragen zu beantworten, können Erfahrungen mit der KAP-Anwendung bei chronischen Wunden und die Entwicklung klinischer Studien zur Behandlung von Hautmalignomen mit KAPs voranbringen [5].
