Einleitung
Einleitung
Das Asthma bronchiale ist eine chronisch-entzündliche Erkrankung unbekannter Ursache. Vom klinischen Aspekt her lässt sich Asthma in eine extrinsisch/atopische und eine intrinsisch/nichtallergische Form einteilen. Beim extrinsischen Asthma sind Allergene an der Entstehung der Atemwegsentzündung und des Bronchospasmus beteiligt, wohingegen die Pathogenese des intrinsischen Asthma völlig unklar ist. Sowohl das allergische als auch das intrinsische Asthma gehen mit einer chronischen T-Zell- und Eosinophilen-vermittelten bronchialen Entzündung einher [[1], [2]]. Die Ätiologie dieser Erkrankungen hingegen ist bis heute unklar. Auf klinischen Beobachtungen basierend lässt sich die Hypothese formulieren, dass dem Asthma eine autoimmunologische Komponente zugrunde liegen könnte [[3]]. Zahlreiche Studien berichten von organ- als auch nichtorganspezifischen Autoantikörpern beim allergischen und/oder intrinsischen Asthma. Zirkulierende Autoantikörper gegen glatte Muskulatur, Schilddrüse, Parietalzellen, Mitochondrien als auch antinukleäre Antikörper und IgG-anti-IgG Antikörper werden in der Literatur beschrieben [[4]
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[7]]. In einigen dieser Studien waren bei Patienten mit intrinsischem Asthma Autoantikörper öfter zu finden [[4], [6]]. Zusätzlich war bei Patienten mit Asthma und gleichzeitiger Aspirinintoleranz die Häufigkeit von antinukleären Antikörpern erhöht und diese Patienten zeigten klinische Zeichen einer Autoimmunerkrankung [[3]]. Andere Studien berichten sowohl beim allergischen als auch beim intrinsischen Asthma von erhöhten Autoantikörperkonzentrationen [[4], [8]]. Andererseits gelang es bisher nicht, diesen Antikörpern im Rahmen der asthmatischen Entzündung eine pathogenetische Bedeutung zuzuordnen.
Bisher gibt es keine Studien, die beim Asthma zellvermittelte Autoimmunphänomene untersuchten. Beim chronisch persistierenden allergischen Asthma, aber insbesondere beim chronisch progredienten intrinsischen Asthma persistieren Entzündungszellen in den Atemwegen. Einige davon besitzen zytolytisches Potenzial. Neben Eosinophilen [[9]] sind auch aktivierte CD8+-T-Lymphozyten [[1]] und natürliche Killer-(NK)-Zellen [[10]] beim allergischen und/oder intrinsischen Asthma vorhanden. Das Verhältnis von CD4+-zu-CD8+-Zellen im peripheren Blut von Patienten mit intrinsischem Asthma ist im Vergleich zu Patienten mit allergischem Asthma und gesunden Kontrollprobanden erhöht [[1]]. Auf welche Weise diese Zellen an der Pathogenese des Asthma beteiligt sind, ist bisher allerdings ebenfalls kaum untersucht.
Perforin, ein 60 kD großes, porenformendes Protein, wird von NK-Zellen, gamma-delta(γδ)-Zellen, zytotoxischen CD8+-T-Lymphozyten und einer kleinen Gruppe von CD4+-T-Lymphozyten gebildet und intrazellulär gespeichert. Bei einer Anzahl chronisch entzündlicher Autoimmunerkrankungen, wie der multiplen Sklerose [[17], [18]], der Takayasu-Arteritis [[19]] oder autoimmuner Schilddrüsenerkrankungen ließen sich vermehrt perforinhaltige Lymphozyten nachweisen. Perforin kann in zahlreichen Zellen, einschließlich T-Lymphozyten, Apoptose auslösen. Dieses könnte einerseits bei einer entzündlichen Immunantwort dazu beitragen, das entzündliche Infiltrat zu beseitigen [[21]
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[23]], andererseits bei der Elimination von virusinfizierten Zellen eine Rolle spielen [[24], [25]]. Da zahlreiche klinische [[26]] als auch immunologische [[1]] Zeichen des intrinsischen Asthma mit einem autoimmunen Geschehen vereinbar sind, prüfen wir nachfolgend die Hypothese, dass beim chronischen Asthma Perforin vermehrt exprimiert wird, was in der Pathogenese der Erkrankungen eine Rolle spielen könnte.
Methoden
Methoden
Probanden
Patienten mit allergischem oder intrinsischem Asthma bronchiale [[1], [28]] wuden für diese Studie ausgewählt. Insgesamt nahmen 13 Probanden mit extrinsischem Asthma (6 Frauen/7 Männer) und einem mittleren Alter von 43 Jahren (22 - 74 Jahre) an der Studie teil. Die mittlere FEV1 lag bei 77,6 +/- 5,9 % (44 - 105 %). Die sieben intrinsischen Asthmatiker (6 Frauen/1 Mann) waren zwischen 41 und 64 Jahren alt, das mittlere Alter lag bei 55 Jahren. Die mittlere FEV1 lag bei 62,4 +/- 8,2 % (31 - 89 %). Für die Kontrollgruppe wurden gesunde Personen (14 Frauen/4 Männer) mit einem durchschnittlichen Alter von 40 Jahren (25 - 65 Jahre) und einem normalen FEV1 ausgewählt.
Alle Patienten stimmten ihrer Teilnahme an der Studie zu; das Protokoll wurde von der Ethik-Kommission des Universitätsklinikums geprüft und genehmigt.
Zellpräparation mononukleärer Zellen
Aus 10 ml venösem Blut (von extrinsischen, intrinsischen bzw. gesunden Probanden) versetzt mit 0,2 % EDTA wurden die mononukleären Zellen (MNC) via Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation (1,07 g/L) isoliert, entsprechend der ausführlichen Beschreibung bei Luttmann u. Mitarb. [[28]]. Die isolierten MNC wurden zweimal mit PBS/2 % hitzeinaktiviertem FCS gewaschen und anschließend auf eine Konzentration von 1 × 106 Zellen/ml gebracht.
Monoklonale Antikörper
Spezifische Oberflächenmoleküle wurden mit monoklonalen Antikörpern markiert: anti-humanes CD3-Phycoerythrin (PE) (Klon UCH1; Dako, Hamburg, Deutschland), anti-humanes CD4-PE (Klon EDU-2; Cymbus Biotechnology, Hants, GB), anti-humanes CD8-PE (Klon DK25; Dako), anti-humanes CD16-PE (Klon 3G8; Immunotech, Hamburg, Deutschland) und anti-humanes CD56-PE (Klon B-A19, Diaclone, Besancon, Frankreich). Zur intrazellulären Perforin-Messung wurde der anti-humane Perforin-Fluoresceinisothiocyanat-Antikörper (FITC) (Klon δG); Hölzel Diagnostik, Köln, Deutschland) verwendet. Als Isotypkontrollen dienten unspezifische IgG-FITC und IgG-PE Antikörper (beide von Dako).
Intrazellulärer Perforinnachweis
Nach der Markierung der Oberflächenantigene mit anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD16 oder anti-CD56 wurden die Zellen in einer 4 %igen Paraformaldehydlösung fixiert, zweimal mit PBS gewaschen und anschließend die Zellmembran mit einer 0,1 %igen Saponinlösung (in PBS) permeabilisiert. Diese Zellen wurden mit FITC-markierten anti-Perforin Antikörpern bei Raumtemperatur 30 min inkubiert, zweimal gewaschen und zum Schluss durchflusszytometrisch analysiert (FACScan, Becton Dickenson, PC-Lysis II).
Statistische Auswertung
Die Ergebnisse sind als Mittelwerte ± Standardfehler (SEM) angegeben. Für die statistische Analyse wurde der Mann-Whitney-U-Test gewählt. Unterschiede mit p < 0,05 wurden als signifikant bezeichnet.
Resultate
Resultate
Verteilung der Lymphozyten-Subpopulationen bei extrinsischen und intrinsischen Asthmatikern und gesunden Probanden
Die Verteilung der Lymphozyten-Subpopulationen wurde im Vollblut der verschiedenen Gruppen untersucht. Dazu wurden die Zellen mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen CD3, CD4, CD8, CD16 und CD56 inkubiert und durchflusszytometrisch analysiert. Wie in Abb. [1] dargestellt, ergaben sich keine signifikanten Unterschiede in der prozentualen Verteilung der CD3+-, CD4+-, CD8+-, CD16+- und CD56+-Subpopulation innerhalb der drei untersuchten Gruppen.
Perforin-positive Lymphozyten
Wurden die Zellen aber über Ficoll isoliert, fixiert und permeabilisiert und dann mit dem Anti-Perforin-Antikörper inkubiert, konnte im Vergleich zu den gesunden Probanden (21,7 ± 2,5 %) ein signifikant höherer Prozentsatz (p < 0,05) an Perforin exprimierenden Zellen bei den extrinsischen (35,3 ± 3,5 %) aber auch den intrinsischen Asthmatikern (37,7 ± 3,9 %) gemessen werden (Abb. [2]). Ein signifikanter Unterschied in der Anzahl der Perforin-exprimierenden Zellen bei extrinsischen im Vergleich zu intrinsischen Asthmatikern war aber hingegen nicht zu beobachten.
Perforin-Expression in den Lymphozyten-Subpopulationen
Um die Perforin-exprimierenden Lymphozyten-Subpopulationen weiter zu charakterisieren, wurden die Zellen mit monoklonalen Antikörpern gegen CD3, CD4, CD8, CD16 und CD56 inkubiert, anschließend fixiert und mit Saponin permeabilisiert. Die permeabilisierten Lymphozyten wurden mit dem anti-Perforin-Antikörper inkubiert. Der prozentuale Anteil an Perforin exprimierenden Zellen war in den CD16+- und CD56+-Zellen am höchsten, aber auch in allen anderen untersuchten Lymphozytenpopulationen wurden Perforin-exprimierende Zellen nachgewiesen, sowohl bei Asthmatikern als auch bei gesunden Probanden. Die Analyse der Daten zeigte keinen Unterschied in der Perforinexpression bei den CD16+-Lymphozyten. Es wurde aber eine signifikant erhöhte Perforinexpression bei den CD3+-, CD4+-, CD8+- und CD56+-Lymphozyten bei extrinsischen Asthmatikern im Vergleich zu den intrinsischen Asthmatikern festgestellt. Die gleichen Resultate konnten bei den CD4+- und CD56+-Zellen von intrinsischen Asthmatikern beobachtet werden. Die Population der Perforin exprimierenden CD3+- und CD8+-Lymphozyten war ebenfalls erhöht, ohne dass diese Ergebnisse statistische Signifikanz aufwiesen. Interessanterweise war der prozentuale Anteil der Perforin- exprimierenden CD4+-Lymphozyten bei intrinsischen Asthmatikern im Vergleich zu den extrinsischen Asthmatikern statistisch signifikant erhöht (Abb. [3]).
Korrelation mit klinischen Parametern
Es fanden sich keine Korrelationen zwischen dem Anteil an Perforin-exprimierenden Lymphozyten oder deren Subpopulationen und klinischen Parametern des Asthmas.
Obwohl der prozentuale Anteil Perforin+/CD3+- und Perforin+/CD8+-Lymphozyten mit dem Alter der Patienten, die an intrinsischem Asthma litten, korreliert waren (r = 0,8 und r = 0,77) war dies nicht mehr statistisch signifikant, wenn die Ergebnisse für multiple Korrelationen korrigiert wurden.
Abb. 1Zusammensetzung der Lymphozyten des peripheren Bluts. Lymphozyten-Subpopulationen aus dem peripheren Blut von Patienten mit extrinsischem Asthma (n = 13), intrinsischem Asthma (n = 7) und Normalpersonen (n = 18) in % aller Lymphozyten. Zwischen den einzelnen Gruppen fanden sich keine signifikanten Unterschiede. Die Untersuchungen erfolgten an Vollblut. Die angegebenen Werte entsprechen dem Mittelwert ± SEM.
Abb. 2Prozentsatz der Perforin-positiven Lymphozyten. Vergleich des prozentualen Anteils der Lymphozyten des peripheren Bluts, die intrazellulär Perforin exprimieren. Patienten mit extrinsischem Asthma (n = 13), intrinsischem Asthma (n = 7) und Normalpersonen (n = 18). *signifikant gesteigerte Expression von Perforin in Lymphozyten von Patienten mit extrinsischem und intrinsischem Asthma im Vergleich mit Normalpersonen. Die angegebenen Werte entsprechen dem Mittelwert ± SEM. *p < 0,05.
Abb. 3Prozentsatz der Perforin-positiven Lymphozyten-Subpopulationen. Vergleich des prozentualen Anteils der Lymphozyten-Subpopulationen des peripheren Bluts, die intrazellulär Perforin exprimieren. Sowohl Patienten mit extrinsischem Asthma (n = 13) als auch Patienten mit intrinsischem Asthma (n = 7) hatten signifikant höhere Anteile Perforin-exprimierender Zellen. Die angegebenen Werte entsprechen dem Mittelwert ± SEM. *p < 0,05, Im Gegensatz zu den anderen Lymphozyten-Subpopulationen fand sich bei den CD16+/Perforin-positiven Lymphozyten zwischen den untersuchten Gruppen kein signifikanter Unterschied. **p < 0,05 im Vergleich mit Patienten mit allergischem Asthma.
Diskussion
Diskussion
Die Ätiologie des Asthma bronchiale ist bis heute nicht geklärt. Trotz der Erkenntnis, dass die allergenabhängige Zunahme der bronchialen Entzündung eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung der zellulären Infiltrate der Bronchien beim allergischen Asthma spielen, bleiben zahlreiche Facetten der Erkrankung, insbesondere ihre Neigung zum chronisch progredienten Verlauf unverstanden. Gegenwärtige Hypothesen erklären nicht, weshalb das Asthma auch in Abwesenheit des Allergens persistieren kann und die Mechanismen, die dem intrinsischen Asthma zugrunde liegen, sind weiterhin unklar. Die klinische Beobachtung, dass das Asthma oft einen chronischen, progredienten Verlauf nimmt, dessen Assoziation mit aktivierten T-Lymphozyten beim allergischen als auch beim intrinsischen Asthma [[1], [2]], die zellvermittelte Zerstörung der bronchialen Mukosa und Vorgänge, die als Atemwegs-Remodeling beschrieben werden [[29]], ferner das positive Ansprechen auf Kortikosteroide, der Nachweis gehäuft vorkommender Autoantikörper [[3]
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[7]] zusammen mit der gesteigerten Inzidenz des intrinsischen Asthmas bei weiblichen Patienten [[30]] sowie der unvorhersagbare Verlauf mit Exazerbationen und Remissionen, aber gelegentlich auch rein progredienten Verlaufsformen unterstützen die Hypothese, dass der Pathogenese des Asthma bronchiale auch autoimmunologische Charakteristika zugrunde liegen.
Bislang wurden beim Asthma zellvermittelte autoimmunologische Phänomene nicht untersucht. In der vorliegenden Studie ließ sich zeigen, dass der Prozentsatz Perforin-positiver Lymphozyten im peripheren Blut sowohl beim allergischen als auch beim intrinsischen Asthma verglichen mit normalen Kontrollprobanden gesteigert ist. Der beobachtete Unterschied der Perforinexpression zwischen Asthmatikern und gesunden Kontrollprobanden bleibt auch dann bestehen, wenn CD3+-, CD4+-, CD8+- und CD56+-Lymphozytensubpopulationen getrennt untersucht werden, was als Zeichen dafür verstanden werden kann, dass insbesondere die Perforinexpression dieser Lymphozytensubpopulationen beim Asthma bronchiale hochreguliert ist. Der beobachtete Unterschied der Perforinexpression von Lymphozyten zwischen Patienten mit Asthma und gesunden Kontrollprobanden ist dabei nicht auf eine selektive Umverteilung der Lymphozytensubpopulationen zurückzuführen, da diese zahlenmäßig innerhalb der drei Gruppen identisch waren (Abb. [1]). So legen unsere Ergebnisse nahe, dass in Anwesenheit ähnlicher Verteilungen von CD3+-, CD4+-, CD8+-, CD16+- und CD56+-Zellen, die vermehrte Perforin-Expression jeder dieser Subpopulationen einen tatsächlichen Anstieg dieser Population im peripheren Blut von Patienten mit Asthma reflektiert.
Kürzlich wurde berichtet, dass der Prozentsatz von CD3+/Perforin+-, CD4+/Perforin+- und CD8+/Perforin+-Zellen mit zunehmendem Alter abnimmt [[31]]. Im Kontrast dazu stehen unsere Beobachtung deutlich erhöhter Perforin-positiver Lymphozyten- und Lymphozytensubpopulationen, vor allem beim intrinsischen Asthma und dies trotz der Tatsache, dass diese Patientengruppe ein höheres Durchschnittsalter gegenüber den normalen Kontrollprobanden aufweist. In Hinblick auf die Erkenntnisse von Rukavina u. Mitarb. [[31]] dürften die beobachteten Unterschiede der Perforinexpression in unserer Arbeit sogar noch stärker ausfallen, wenn die Werte nach Alter korrigiert würden. Andererseits legt unsere Beobachtung, dass die Perforin-exprimierenden Lymphozytensubpopulationen beim allergischen Asthma und normalen Kontrollprobanden trotz ähnlicher Altersverteilung unterschiedlich sind, nahe, dass die Ergebnisse unserer Untersuchung nicht alleine auf das Alter der beteiligten Probanden zurückgeführt werden können.
Obwohl wir somit erstmals einen erhöhten Prozentsatz an Perforin-positiven Lymphozyten bei Patienten mit Asthma bronchiale zeigen können, gibt unsere Untersuchung keinen Aufschluss über die funktionelle oder klinische Bedeutung dieser Zellen bei den untersuchten Erkrankungen. Inwieweit diese Zellen tatsächlich zytotoxisches Potenzial besitzen bleibt unklar und es gibt bislang keine funktionellen Studien beim Menschen, die zur Beantwortung dieser Frage herangezogen werden könnten.
Gesunde Freiwillige exprimieren Perforin intrazellulär in NK- und CD8+-Zellen, aber nur zu einem geringen Prozentsatz in CD4+-Lymphozyten [[32]]. Nakata u. Mitarb. konnten mittels Immunzytochemie in unstimulierten CD4+-T-Lymphozyten gesunder Kontrollpersonen überhaupt keine Expression von Perforin nachweisen [[16]]. Dies steht im Gegensatz zu unseren Ergebnissen, die einen geringen Prozentsatz an Perforin-positiven CD4+-Zellen in gesunden Kontrollpersonen zeigen. Ein erhöhter Anteil Perforin+/CD4+-Zellen wurde bei der infektiösen Mononukleose [[16]] und nach Therapie beim Morbus Hodgkin [[33]] beschrieben. Auch bei der Wegnerschen Granulomatose zeigen periphere Lymphozyten einen vermehrten Anteil von Perforin+/CD4+-Zellen (M. Schlesier, Freiburg, persönliche Mitteilung). Interessanterweise konnte in unserer Studie der höchste Anteil dieser Zellen bei Patienten mit intrinsischem Asthma gefunden werden. Da bislang nur wenige Informationen über die physiologische Rolle und vermeintliche zytotoxische Eigenschaften CD4+ MHC II-Klasse restringierter T-Zellen bekannt ist, lässt sich über die Rolle Perforin+-/CD4+-Zellen beim Asthma bronchiale nur spekulieren. Für mehrere chronisch entzündliche Erkrankungen aus dem Formenkreis der Autoimmunerkrankungen wurde eine erhöhte Perforinexpression beschrieben. Hierzu zählen die multiple Sklerose [[17], [18]], die Takayasu-Arteriitis [[19]], Autoimmunerkrankungen der Schilddrüse [[20]] und der Morbus Crohn. Perforin wurde in diesen Fällen auf mononukleären Zellen, CD4+-, CD8+-, CD16+-, γ/δ-T-Zellen oder NK-Zellen nachgewiesen. Unsere Untersuchungen an Patienten mit Asthma bronchiale ergaben erhöhte Werte der potenziell zytotoxischen CD4+- und CD8+-T-Lymphozyten im peripheren Blut. Dieses Ergebnis bestätigt unsere Hypothese, dass auch beim Asthma bronchiale eine Autoimmunreaktion an der Pathogenese beteiligt sein dürfte.
Es gibt verschiedene Möglichkeiten, durch die der gesteigerte Anteil Perforin-positiver T-Lymphozyten mit der chronischen Entzündung beim Asthma verknüpft sein könnte. Die systemische Gabe von Interleukin-2 (IL-2) im Rahmen einer Immuntherapie steigert die Zahl Perforin+/CD4+-T-Zellen [[36]], was darauf hinweist, dass der Effekt der IL-2-Immuntherapie über zytolytische Lymphozyten vermittelt wird. Vergleichbar dazu wurde Perforin-vermittelte Zytotoxizität mit dem durch IL-2 induzierten „vascular leak syndrome” in Verbindung gebracht, bei dem IL-2 offenbar die Perforin-Expression steigert [[37]]. Erhöhte IL-2-Konzentrationen wurden sowohl in der BAL beim intrinsischen Asthma als auch nach segmentaler Allergenprovokation beim allergischen Asthma nachgewiesen [[2]]. Folglich könnten erhöhte IL-2-Konzentrationen, wie beim Asthma in anderen Studien nachgewiesen, zur Zahl der Perforin-positiven Lymphozyten in unserer Studienpopulation beigetragen haben.
Andererseits ist aus Tiermodellen des Lupus erythematodes bekannt, dass Perforin-defiziente Tiere einen schwereren Krankheitsverlauf nehmen, was darauf hinweist, dass der zytolytischen lymphoiden Regulation eine zentrale Bedeutung bei der Immun-Homöostase zukommt [[38]]. Inwieweit der erhöhte Anteil Perforin+-Lymphozyten unserer Patienten Zeichen einer gesteigerten zytolytischen Aktivität im Rahmen der Asthmapathogenese sind oder stattdessen eine Reaktion des Immunsystems zur Elimination reichlich vorhandener Entzündungszellen darstellt, lässt sich derzeit nicht zweifelsfrei beantworten.
Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass das Asthma bronchiale mit einem gesteigerten Anstieg potenziell zytolytischer Perforin+-Lymphozyten vergesellschaftet ist. Die funktionelle Relevanz dieser Befunde in der Pathogenese des Asthmas ist unklar. Auch wenn eine Verbindung dieser Zellen mit der Pathologie beim Asthma aus unseren Ergebnissen möglich scheint, so ist ein kausaler Zusammenhang zwischen Asthma und Perforinexpression offen und sollte weiter untersucht werden.
