Immunmikroskopischer Nachweis von Majorallergenen in Pollen von Wiesenlieschgras (Phleum pratense L.)

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Gräserpollen stellen die wichtigste Quelle von Außenluft-Allergenen dar. Die immunzytochemische Darstellung von Allergenen in Gräserpollen ist immer noch weitgehend unzuverlässig, obwohl einige Einzelarbeiten in diesem Bereich bekannt sind [1] [2] [3] [4]. Der Nachweis von Allergenen in Pollen kann aufgrund der extrem hohen Wasserlöslichkeit der Allergene nur unter strikt wasserfreien Bedingungen gelingen. Daher war unser Ziel, neue Verfahren, vor allem Tieftemperatur-Verfahren, zu entwickeln, die aufgrund einer optimalen Konformationserhaltung des Epitopes die Visualisierung von Allergenen in situ erlauben.

Die Wiesenlieschgraspollen (Allergon, Välinge, Schweden) wurden wasserfrei entweder mit Acrolein-Dampf (Riedel-de-Haën, Seelze) oder mit Mischungen aus Glutaraldehyd (GA; 70 %, EM grade; Polysciences, Warrington, PA., USA) und Paraformaldehyd (PFA; Sigma, St. Louis, Mo., USA) in 2,2-Dimethoxypropan (DMP; Sigma) fixiert. Eine Konzentration von 0,5 % GA + 0,5 % PFA in DMP 24 hr bei Raumtemperatur zeigte die besten Ergebnisse. Zur Lokalisierung der Allergene in Pollen wurden Kryoschnitte, Semidünnschnitte und gefriergebrochene Pollen mit monoklonalen Antikörpern (mAk IG 12 [5] gegen Phl p 1 bzw. mAk Bo 1 [6] gegen Phl p 5) inkubiert. Als sekundäre Antikörper wurden an FITC konjugierte Kaninchen-Anti-Maus-IG (DAKO, Hamburg) oder an Gold gekoppelte Kaninchen-Anti-Maus-IgG/M (Aurion, Wageningen, NL), mit Silberverstärkung verwendet.

Die Methoden zum Allergennachweis umfassten:

1. indirekte Immunfluoreszenz an Gefrierschnitten für lichtmikroskopische Verfahren,

2. indirekte Immungold-Silber-Markierung an Gefrierschnitten und gefriergebrochenen Pollen für rasterelektronenmikroskopische Verfahren im JSM-6400F und JSM-6300 (JEOL, Tokyo, Japan) mit Sekundärelektronen(SE)- und Rückstreu(RE)-Detektoren,

3. indirekte Immungold-Silber-Markierung an Kunstharz- (Epon, LR-Gold und Lowicryl K4M)Semidünnschnitten für lichtmikroskopische und transmissionselektronenmikroskopische Verfahren.

Für die Rasterelektronenmikroskopie wurden die Pollen nach Entwässerung in aufsteigender Ethanolreihe und Kritisch-Punkt-Trocknung mit einer 10-nm-Goldschicht besputtert. Lichtmikroskopische Untersuchungen am Semidünnschnitt erfolgten sowohl im Durchlicht als auch mit Epipolarisation sowie am Kryoschnitt mit Epifluoreszenz. Die genauen Verfahrensabläufe zeigt Abb. [1].

Im Ergebnis zeigte sich die beste Morphologie nach Fixierung in 0,5 % GA + 0,5 % PFA in DMP-24 hr bei RT. Es wurde keine positive Markierung gefunden bei Fixation mit Acrolein-Dampf und auch nicht bei Fixation mit GA bzw. GA + PFA (in DMP) in Konzentrationen > 0,5 % GA.

Eine detaillierte Analyse der bevorzugten Lokalisationsorte der von uns nachgewiesenen Majorallergene Phl p 1 und Phl p 5 weist auf unterschiedliche Allergenverteilungsmuster hin: Phl p 1 zeigt sich im Bereich der äußeren Anteile der Intine und an der Pollenoberfläche im Porenbereich, während Phl p 5 vorwiegend in der zytoplasmatischen Matrix sowie in Zwischenräumen und Mikrokanälen der Exine erscheint (Abb. [2]).

Auf der Pollenoberfläche war die Phl p 5-Markierung nicht über die ganze Oberfläche gleichmäßig verteilt, sondern zwischen den Inseln des Tectums (spinulose exine) zu finden. Die räumliche Expression von Phl p 5 nach der Immungoldmarkierung weist auf eine „natürliche” Freisetzung der Allergene durch Mikrokanäle der Exine auf die Pollenoberfläche hin.

Bei dieser Studie handelt es sich um

• die erste komplexe Studie zum Vergleich verschiedener Fixations-, Einbettungs- und Entwässerungsmethoden und Mikroskopieverfahren zur Darstellung von hochdiffusiblen Allergenen in Gräserpollen

• die erste Applikation der konventionellen- und Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopie zur intrazellulären 3D-Darstellung von Hauptallergenen in Pollen von Phleum pratense L.

Abb. 1Schematische Darstellung der angewendeten Methoden zum Allergennachweis in Pollen.

Abb. 2Immungold-Silber-Markierung von Phl p 5 Majorallergen am Semidünnschnitt. Fixation mit 0,5 % GA + 0,5 % PFA in DMP, LR-Gold-Einbettung bei -25 °C (Bild wurde publiziert: Behrendt et al. Int Arch Allergy Immunol 1997; 113: 69).

Literatur

• 1 Behrendt H, Tomczok J, Sliwa-Tomczok W, Kasche A, Ebner von Eschenbach C, Becker W M, Ring J. Timothy grass (Phleum pratense L.) pollen as allergen carriers and initiators of an allergic response.  Int Arch Allergy Immunol. 1999;  118 414-418
• 2 Grote M, Dolecek C, Van Ree R, Valenta R. Immunogold electron microscopic localization of timothy grass (Phleum pratense L.) pollen major allergens Phl p I and Phl p V after anhydrous fixation in acrolein vapor.  J Histochem Cytochem. 1994;  3 427-431
• 3 Singh M B, Taylor P E, Knox R B. Special preparation methods for immunocytochemistry of plant cells. In: Beesley JE, ed. Immunocytochemistry. A practical approach Oxford: Oxford University Press 1993: 77-102
• 4 Taylor P E, Staff I A, Singh M B, Knox R B. Localization of the two major allergens in rye-grass pollen using specific monoclonal antibodies and quantitative analysis of immunogold labelling.  Histochem J. 1994;  26 392-401
• 5 Petersen A, Schramm G, Bufe A, Schlaak M, Becker W M. Structural investigations of the major allergen Phl p I on the complementary cDNA and protein level.  J Allergy Clin Immunol. 1995;  95 987-994
• 6 Becker W M, Schaubschläger W, Westphal W, Schlaak M. Purification of grass pollen allergens by means of immobilized monoclonal antibodies. In: Chmiel H, Hammes WP, Baily JE, eds. Biochemical Engineering Stuttgart: Gustav Fischer Verlag 1988: 440-442