Durch die selektive, minimal-invasive Technik der Wächterlymphknotenbiopsie (WLKB) steht seit gut 10 Jahren ein diagnostisches Verfahren im Stadium der klinischen Erprobung, welches den regionären Lymphknotenstatus mit hohem prädiktiven Wert erfasst [29]. Durch eine Reihe von Arbeiten konnte demonstriert werden, dass der Wächterlymphknoten (WLK) eine herausragende diagnostische und prognostische Bedeutung für Patienten mit primärem kutanen Melanom besitzt [8]
[15]
[24]
[38].
Zuverlässigkeit der Wächterlymphknotenbiopsie
Zuverlässigkeit der Wächterlymphknotenbiopsie
Verschiedene Faktoren können jedoch die Zuverlässigkeit der WLKB, eine regionäre Lymphknotenmetastasierung anzuzeigen, beeinflussen. Hier ist zum einen, die, wenn auch geringe Rate von Patienten mit einer regionären Lymphknotenmetastasierung bei Vorliegen eines histologisch negativen WLK aufzuführen [5]
[15]
[28]
[28]
[36]
[42]
[43] (Tab. [1]). In der Mehrzahl der Arbeiten wurden diese Untersuchungen bei Patienten mit am Körperstamm und an den Extremitäten lokalisierten Melanomen durchgeführt. Hier zeigte sich in bis zu 2 % der Patienten eine regionäre Lymphknotenmetastasierung trotz negativem WLK. Allerdings kann die Rate von Patienten mit metastatischem Lymphknotenbefall bei negativem WLK in Abhängigkeit von der Lokalisation des Primärtumors deutlich variieren. Für Melanome im Kopf-/Hals-Bereich ist die Durchführung der WLKB deutlich diffiziler. Für diese Lokalisation konnte bei 7 % der Patienten eine regionäre Lymphknotenmetastasierung bei negativem WLK dokumentiert werden [21].
Tab. 1 Metastasen in nachgeschalteten Lymphknoten bei negativem WLK
| Autor, Jahr | Detektionstechnik | Detektionsrate (%) | Lymphknotenmetastasen bei negativem WLK (%) |
| Morton et al. 1992 | Farbstoff | 82 | 2 |
| Morton et al. 1993 | Farbstoff | 90 | 0 |
| Uren et al. 1994 | Farbstoff* | 98 | 2 |
| Reintgen et al. 1994 | Farbstoff* | 100 | 0 |
| Thompson et al. 1995 | Farbstoff* | 87 | 2 |
| Blaheta et al. 1999 | LAS | 92 | 1 |
| Gershenwald et al. 1999 | Farbstoff + LASx
| 95 | 1 |
| Jansen et al. 2000 | Farbstoff + LAS | 90 | 7 |
| *Mit Lymphabstromszintigraphie (ohne intraoperative Gamma-Sonde); LAS: Lymphabstromszintigraphie und mit intraoperativer Gamma-Sonde; x nicht in allen Patienten durchgeführt. |
Welche Kriterien sollten berücksichtigt werden, um eine möglichst hohe Zuverlässigkeit der WLKB zu gewährleisten? Die Aufnahme des Radiokolloids und damit die Detektionsrate wird wesentlich von der physiologischen Integrität, d. h. der funktionellen Kapazität des WLK beeinflusst [13]. Wenn Lymphknotenparenchym durch Tumorgewebe ersetzt worden ist, kann aufgrund der verringerten lymphatischen Kapazität nur eine verminderte Aufnahme des Radiotracers erfolgen. Zudem können bei ausgeprägter Tumorinfiltration des WLK afferente Lymphgefäße obstruiert werden. Dadurch kann sich der afferente Lymphabfluss substanziell ändern [7]. Dies kann zur Folge haben, dass durch Ausbildung von Umgehungskreisläufen der eigentliche WLK umgangen wird und ein nachgeschalteter Lymphknoten zum „WLK” wird. Insofern gilt ein klinisch negativer Lymphknotenstatus als Grundvoraussetzung für die Durchführung einer WLKB. Neben diesen beschriebenen Einflussfaktoren wird die diagnostische und damit prognostische Bedeutung des WLK vor allem durch die Sensitivität und Spezifität des jeweiligen Tumorzellnachweises (Histologie, Molekularbiologie) bestimmt.
Histopathologische Untersuchungen des Wächterlymphknotens
Histopathologische Untersuchungen des Wächterlymphknotens
Die selektive Entnahme eines repräsentativen WLK ermöglicht es, diesen sehr differenziert nach Tumorzellen zu untersuchen. Die Nachweisgenauigkeit wird unter anderem bestimmt durch die Art des histologischen Tumorzellnachweises: Durchführung einer konventionellen Hämatoxylin-Eosin-(H & E)Färbung bzw. von immunhistochemischen Detektionsverfahren. Mittlerweile wurde eine Vielzahl von klinischen Studien zur WLKB publiziert, in denen insbesondere in den aktuelleren Arbeiten auch immunhistochemische Untersuchungen zur histopathologischen Aufarbeitung des WLK durchgeführt wurden [1]
[5]
[8]
[15]
[16]
[17]
[22]
[23]
[26]
[ 29]
[30]
[34]
[36]
[38]
[42]. Hierbei zeigte sich, dass in ungefähr 20 % (9 bis 42 %) der Patienten mit primärem Melanom metastatische Absiedlungen in den WLK gefunden werden konnten (siehe Tab. [2]).
Tab. 2 Histopathologische Detektion von Tumorzellen in WLK
| Autor, Jahr | histologische Marker | Patienten | positive Patienten |
| Morton et al. 1992 | H & E, S-100, NKIC3 | 194 | 40/194 (21 %) |
| Reintgen et al. 1994 | H & E, S-100*, HMB-45* | 42 | 8/42 (19 %) |
| Krag et al. 1995 | H & E | 118 | 15/118 (13 %) |
| Pijpers et al. 1995 | H & E | 41 | 8/41 (20 %) |
| Thompson et al. 1995 | H & E | 105 | 22/105 (21 %) |
| Albertini et al. 1996 | H & E, S-100*, HMB-45* | 106 | 16/106 (15 %) |
| Glass et al. 1996 | H & E, S-100, HMB-45 | 148 | 21/148 (14 %) |
| Leong et al. 1997 | H & E, S-100* | 160 | 30/160 (19 %) |
| Gogel et al. 1998 | H & E, S-100*, HMB-45* | 68 | 6/68 (9 %) |
| Mraz-Gernhardt et al. 1998 | H & E, S-100, HMB-45 | 215 | 46/215 (21 %) |
| Shivers et al. 1998 | H & E | 114 | 23/114 (20 %) |
| Blaheta et al. 1999 | H & E, S-100, HMB-45 | 73 | 13/73 (18 %) |
| Bostick et al. 1996 b | H & E, S-100, HMB-45 | 72 | 17/72 (24 %) |
| Gershenwald et al. 1999 | H & E, S-100, HMB-45 | 580 | 85/580 (15 %) |
| Lukowsky et al. 1999 | H & E, S-100 | 24 | 10/24 (42 %) |
| *Nicht routinemäßig durchgeführt. |
Aufgrund der verbesserten Sensitivität zur Tumorzelldetektion, gegenüber einer alleinigen H & E-Analyse, wird die Durchführung der Immunhistochemie mittlerweile als essenzieller Bestandteil bei der histologischen Beurteilung von WLK angesehen. Trotz der dadurch verbundenen Verbesserung der histopathologischen Untersuchung können durch die routinemäßige Diagnostik des WLK „okkulte” Tumorzellen übersehen werden.
Molekularbiologische Untersuchungen des Wächterlymphknotens
Molekularbiologische Untersuchungen des Wächterlymphknotens
In den letzten zwei Jahrzehnten gelang es, durch die Entwicklung neuer analytischer molekularbiologischer Techniken, Tumorzellen aufgrund der Expression tumorspezifischer oder -assoziierter Gene extrem sensitiv nachzuweisen [35]. Die spezifischen Zielsequenzen der entsprechenden Gene können mittels einer geschachtelten Reverse Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (nested RT-PCR) exponenziell amplifiziert und damit selbst eine minimale Anzahl von Tumorzellen nachgewiesen werden. Hierdurch kann die Sensitivität zum Tumorzellnachweis im Lymphknoten gegenüber dem „Goldstandard” der Histopathologie signifikant gesteigert werden [31]
[45]. Für den molekularbiologischen Nachweis von Melanozyten stehen spezifische gewebe- und tumorassoziierte Marker zur Verfügung. Von den gewebeassoziierten Markern wurde das Schlüsselenzym der Melaninbiosynthese, Tyrosinase, am intensivsten für die RT-PCR-Analyse von (Wächter-)Lymphknoten verwendet. Da Melanozyten mit Ausnahme von nodalen Nävuszellnestern nicht in Lymphknoten lokalisiert sind, wird die Expression des Tyrosinase-Gens als Nachweis von Tumorzellen gewertet.
Durch den Einsatz der extrem sensitiven RT-PCR-Technik konnte eine Tyrosinase-Expression in (Wächter-)Lymphknoten zwischen 49 und 73 % der Patienten mit primärem Melanom nachgewiesen werden [3]
[5]
[25]
[38]
[44]
[45] (Tab. [3]). Bezogen auf Patienten mit histopathologisch negativen (Wächter-)Lymphknoten konnte in diesen Studien eine Tyrosinase-Expression bei 38 - 65 % der Patienten demonstriert werden. Die Spezifität dieser molekularen Nachweismethode konnte demonstriert werden, indem in fast allen histopathologisch positiven (Wächter-) Lymphknoten auch eine Tyrosinase-Genexpression nachgewiesen werden konnte. Dennoch kann aufgrund der Heterogenität der Genexpression in metastasierenden Melanomen nicht erwartet werden, Tyrosinase in allen histologisch nachgewiesenen Lymphknotenmetastasen nachzuweisen [11]
[32]. Deshalb wurden neben Tyrosinase gleichzeitig noch weitere Marker zur molekularen Diagnostik eingesetzt. So wurden von Bostick u. Mitarb. mehrere spezifische Marker (Tyrosinase, Melan A/MART-1 und MAGE-3) gleichzeitig zur PCR-Analyse von WLK eingesetzt [8]. Durch diese Multimarker-PCR konnte die Sensitivität der Methode gesteigert werden, indem bei gleichzeitigem Nachweis von mindestens zwei Markergenen, die Nachweisrate sogar auf 79 % erhöht werden konnte (Tab. [3]).
Tab. 3 Molekularer Nachweis von Tumorzellen in (Wächter-)Lymphknoten
| Autor, Jahr | molekulare Marker | histologisch + | PCR + | histologisch - PCR + |
| Wang et al. 1994 | Tyrosinase | 11/29 (38 %) | 19/29 (66 %) | 8/18 (44 %) |
| Velde-Z. et al. 1996 | Tyrosinase | 4/16 (25 %) | 10/16 (63 %) | 6/12 (50 %) |
| Bieligk et al. 1998 | Tyrosinase | 6/26 (23 %) | 19/26 (73 %) | 13/20 (65 %) |
| Shivers et al. 1998 | Tyrosinase | 23/114 (20 %) | 70/114 (61 %) | 47/91 (52 %) |
| Blaheta et al. 1999 | Tyrosinase | 13/73 (18 %) | 36/73 (49 %) | 23/60 (38 %) |
| Li et al. 2000 | Tyrosinase | 52/233 (22 %) | 163/233 (70 %) | 111/181 (61 %) |
| Bostick et al. 1999 b | Tyrosinase, MAGE-3, Melan A | 17/72 (24 %) | 36*/72 (79 %) | 20*/55 (36 %) |
| * Expression von mindestens zwei Tumormarkern. |
Die Spezifität der Tyrosinase-RT-PCR wurde außerdem evaluiert, indem Lymphknoten bzw. -aspirate von Patienten ohne Melanom untersucht wurden [3]
[4]
[8]
[19]
[20]
[37]
[44]
[46]. Insgesamt wurden in diesen Arbeiten gut 250 Lymphknoten als Negativkontrollen auf eine mögliche Tyrosinase-Genexpression untersucht. In diesen Studien wurde in lediglich zwei Lymphknoten (< 1 %) Tyrosine-mRNA nachgewiesen, die hohe Spezifität dieses Assays dokumentierend. Bei einem dieser beiden positiven Lymphknoten konnten histologisch Nävozyten als Ursache eines falsch positiven Tyrosinase-Befundes nachgewiesen werden. Analog wurden Untersuchungen zur Melan-A-Expression in Lymphknoten von Kontrollpersonen (Patienten mit nicht-melanozytären Erkrankungen) durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass Melan A bei 3 (13 %) von 24 untersuchten Patienten nachgewiesen werden konnte (eigene Daten, noch nicht publiziert). Damit werden die Ergebnisse von Palmieri u. Mitarb. bestätigt, welche bei einem von 18 Patienten (6 %), die als Negativkontrollen dienten, Transkripte von Melan A detektierten [33]. Insofern muss zum derzeitigen Zeitpunkt Tyrosinase als zuverlässigster molekularer Tumormarker angesehen werden. Um falsch positive PCR-Ergebnisse auszuschließen, müssen ausschließlich PCR-positive WLK sehr genau nach Nävozyten untersucht werden. Benigne Nävuszellaggregate können aufgrund ihrer typischen Morphologie, der klassischen intrakapsulären Lokalisation und ihrer Immunreaktivität (S-100 positiv, HMB-45 negativ) relativ leicht detektiert und gegenüber metastatischen Melanomzellen abgegrenzt werden [10]. Allerdings muss hierbei berücksichtigt werden, dass das für die molekulare Analyse eingesetzte Material histologisch nicht mehr untersucht werden kann (sog. sampling error). Insofern können falsch positive PCR-Ergebnisse nicht obligat ausgeschlossen werden.
Klinische Relevanz von histologisch nachgewiesenen Tumorzellen
Klinische Relevanz von histologisch nachgewiesenen Tumorzellen
Durch eine Reihe von Arbeiten konnte aufgezeigt werden, dass der histologische Status des WLK ein exzellenter prognostischer Faktor ist [12]
[15]
[17]
[27]
[41]. Im Rahmen einer Multizenterstudie wurde der Einfluss des histologischen Status des WLK auf das rezidivfreie Überleben bei Patienten mit primärem Melanom untersucht [15]. In diese Studie wurden 612 Patienten aufgenommen, die über einen Zeitraum von 40 Monaten (Median) nachuntersucht wurden. In einer multivariaten Analyse konnte der histologische WLK-Status - neben der Tumordicke - als hochsignifikanter Prognosefaktor identifiziert werden. Zusätzlich ist es möglich, anhand der mikromorphometrisch bestimmten Tumorlast des WLK, innerhalb der nodal metastasierenden Patienten prognostisch heterogene Gruppen zu differenzieren. Anhand der Maximum-Likelihood-Methode konnte demonstriert werden, dass mit zunehmender nodaler Metastasengröße (als stetige Variable berücksichtigt) eine signifikante Verkürzung des rezidivfreien Überlebens verbunden ist (eigene Daten, noch nicht publiziert). Dieser Zusammenhang war insbesondere im Bereich von einem sehr geringen Metastasendurchmesser evident. Mit zunehmender Größe des Metastasendurchmessers (insbesondere ab 4 mm) zeigte sich, dass dieser prognostische Einfluss deutlich an Relevanz verlor. Insgesamt können damit die Ergebnisse von Starz u. Mitarb. zur prognostischen Signifikanz der nodalen Metastasengröße bestätigt werden [39]
[40]. Sollten sich diese vielversprechenden Ergebnisse in prospektiven Studien mit standardisierten Untersuchungsbedingungen unter Einschluss einer größeren Patientenzahl bestätigen, könnte die mikromorphometrische Quantifizierung des Tumorbefalls im WLK dazu beitragen, zu einer besseren individuellen Prognoseschätzung zu gelangen. Möglicherweise könnte die nodale Tumormasse dann als zusätzlicher Stratifizierungsfaktor für weiterführende Therapieentscheidungen herangezogen werden (z. B. Durchführung von adjuvanten Immuntherapien oder einer radikalen Lymphonodektomie).
Klinische Relevanz von molekularbiologisch nachgewiesenen Tumorzellen
Klinische Relevanz von molekularbiologisch nachgewiesenen Tumorzellen
Bei relativ kurzen Nachbeobachtungszeiten von unter 2 Jahren konnte in verschiedenen Studien nachgewiesen werden, dass die molekulare Detektion von Melanomzellen eine klinische Relevanz hinsichtlich des Auftretens einer Tumorprogression besitzt [6]
[8]
[24]
[38]. Um dies zu demonstrieren, wurde der Status des WLK anhand der Ergebnisse von Histologie und Molekularbiologie in drei Gruppen eingeteilt (Tab. [4]). Patienten mit einem histologisch positiven WLK wurden der Gruppe I zugeordnet. Patienten mit histologisch negativem WLK-Status konnten aufgrund des PCR-Befundes in Gruppe II (Histologie negativ, PCR positiv) bzw. Gruppe III (Histologie negativ, PCR negativ) aufgeteilt werden.
Tab. 4 Rezidivraten in Abhängigkeit vom Status des WLK
| Autor, Jahr | Gruppe I
Histologie + PCR + | Gruppe II
Histologie -
PCR + | Gruppe III
Histologie -
PCR - |
| Shivers et al. 1998 | 14/23 (61 %) | 6/47 (13 %) | 1/44 (2 %) |
| Bostick et al. 1999 b | 5/16 (31 %) | 3/20* (15 %) | 0/35 (0 %) |
| Li et al. 2000 | 18/49 (37 %) | 11/109 (10 %) | 1/64 (2 %) |
| Blaheta et al. 2000 | 10/15 (67 %) | 9/36 (25 %) | 4/65 (6 %) |
| * Expression von mindestens zwei mRNA Markern. |
Patienten mit histologisch positiven WLK (Gruppe I) wiesen die höchsten Rezidivraten (31- 67 %) auf. Innerhalb der histopathologisch negativen Patienten konnten durch die PCR zwei Gruppen differenziert werden (II und III), die sich in der Rezidivrate bzw. im rezidivfreien Überleben signifikant unterschieden (p < 0,05) [6]
[38]. So entwickelten Patienten, die bei negativem histologischen WLK-Ergebnis aufgrund einer positiven PCR der Gruppe II zugeordnet wurden, in 10 - 25 % eine Tumorprogression. Demgegenüber zeigten PCR-negative Patienten (Gruppe III) deutlich niedrigere Rezidivraten, welche zwischen 0 und 6 % lagen. Diese Ergebnisse unterstreichen, dass durch die molekulare Analyse des WLK Tumorzellen identifiziert werden können, die biologisch aktiv und damit klinisch relevant sind. Die PCR-Positivität des WLK ist jedoch überraschend hoch und übersteigt damit deutlich die Rate von Patienten, bei denen im weiteren Krankheitsverlauf eine Metastasierung erwartet werden muss. In der Tat, eine Metastasierung wurde bei ungefähr 30 % aller Patienten mit primärem Melanom (Tumordicke > 1 mm) beschrieben [9]
[14]. Insofern darf nicht erwartet werden, dass bei allen Patienten mit positiven molekularbiologischen Befunden eine Krankheitsprogression eintritt. Was ist die Ursache für die Diskrepanz zwischen der hohen Rate von positiven PCR-Befunden und der „verhältnismäßig” niedrigen Rate von Patienten, in welchen tatsächlich eine Melanomprogression zu erwarten ist? Ist die extrem hohe Sensitivität der PCR möglicherweise die Ursache für falsch positive molekularbiologische Befunde? Wie bereits ausgeführt, können nodale Nävozyten eine Ursache für „falsch positive” PCR-Befunde sein. Allerdings kann dieses Phänomen die hohe Rate positiver PCR-Befunde nur bedingt erklären. Auf der anderen Seite werden durch die PCR, Tumorzellen unabhängig von ihrem Metastasierungspotenzial nachgewiesen [2]. Das bedeutet, dass der molekularbiologische Nachweis von tumorspezifischen Markern nicht notwendigerweise eine autonome Tumorzellproliferation indiziert. Insofern darf der alleinige PCR-Nachweis von Tumortranskripten nur als eine notwendige Voraussetzung, keinesfalls jedoch als hinreichende Bedingung für eine nachfolgende Metastasierung betrachtet werden. Dementsprechend kann zum jetzigen Zeitpunkt die klinische Bedeutung des molekularen Stagings nicht abschließend beurteilt werden. Der alleinige molekulare Nachweis melanozytärer Zellen im WLK stellt zum derzeitigen Zeitpunkt keinen validen Parameter dar, um daraus eine Therapieindikation, außerhalb von klinischen Studien zu stellen. Derzeit werden in der Sunbelt-Melanoma-Studie, PCR-Ergebnisse des WLK als Kriterium herangezogen, um nach Randomisierung, Patienten in verschiedene Therapiearme zu integrieren.
Perspektiven
Perspektiven
Durch die WLKB steht eine minimal-invasive, diagnostische Methode zur Verfügung, durch welche der regionäre Lymphknotenstatus mit hohem prädiktiven Wert erfasst werden kann [29]. Es konnte demonstriert werden, dass der histologische Status des WLK eine herausragende prognostische Bedeutung für Patienten mit primärem kutanen Melanom besitzt. Daneben können, innerhalb der histologisch positiven Patienten, anhand des Tumordurchmessers des WLK prognostisch heterogene Gruppen differenziert werden. Insofern mag dieser prognostische Faktor (Metastasendurchmesser des WLK) zukünftig eine Bedeutung für klinische Entscheidungen erlangen, so z. B. für adjuvante Therapien oder die bisher obligate Durchführung einer radikalen Lymphknotendissektion nach histologisch positivem WLK. Durch die zusätzliche Durchführung von molekularbiologischen Untersuchungen des WLK konnte eine Verbesserung der prognostischen Relevanz (gegenüber der alleinigen histopathologischen Untersuchung) aufgezeigt werden. Zukünftig könnte durch den quantitativen Nachweis von molekularen Tumorzelltranskripten (Real-time-PCR), die prognostische Signifikanz der molekularen Diagnostik möglicherweise verbessert werden. Inwieweit die quantitative Analyse des zuverlässigsten melanozytären Markers, Tyrosinase, aussagekräftig genug ist oder ob durch Berücksichtigung weiterer molekularer Marker zusätzliche prognostische Informationen gewonnen werden können, wird durch zukünftige Studien zu untersuchen sein. Insgesamt erscheint diese Nachweismethode gegenüber der konventionellen PCR sehr vielversprechend, auch wenn klinische Daten zum Melanom zum derzeitigen Zeitpunkt noch ausstehen.
Inwieweit durch die Exstirpation des WLK bzw. bei nodaler Metastasierung durch die radikale Lymphknotendissektion ein Überlebensvorteil für diese Patienten verbunden ist, muss durch prospektive Studien nachgewiesen werden. Diese Frage wird zur Zeit im Rahmen einer großen, prospektiv-randomisierten Studie geprüft (sog. Sunbelt Melanoma Trial).
