Lösliche Serumfaktoren als prognostische Marker des Melanoms: sHLA, sFas und IL-8

Einleitung

Die Inzidenz des malignen Melanoms ist weltweit steigend [1]. Trotz intensiver Bemühungen in der Entwicklung neuer Therapieansätze sind die Erfolge in der Behandlung des metastasierten Melanoms bis heute eher als eingeschränkt zu werten. Umso mehr erscheint es wichtig, Patienten mit erhöhter Wahrscheinlichkeit einer Erkrankungsprogression im Sinne einer lymphogenen oder hämatogenen Metastasierung zu einem möglichst frühen Zeitpunkt zu identifizieren. Diese Patienten könnten in der Folge einer engmaschigeren klinischen oder apparativen Nachsorge-Diagnostik bzw. adäquaten therapeutischen Maßnahmen unterzogen werden. Es besteht somit die Notwendigkeit, für das maligne Melanom nicht „Tumormarker” im Allgemeinen, sondern „prognostische Marker” im Speziellen zu identifizieren und in der Folge hinsichtlich ihrer Wertigkeit und prädiktiven Aussagekraft zu evaluieren. Diese Marker müssten somit nicht zwangsläufig spezifisch für die Tumorentität Melanom sein, da sie nicht zur Diagnosefindung oder zur Verlaufskontrolle, sondern zur Einschätzung des progressionsfreien und des Gesamtüberlebens des Patienten zu einem definierten Zeitpunkt eingesetzt werden sollten. Als Haupteinsatzgebiet derartiger Marker käme die Einschätzung der Prognose von Melanompatienten nach operativ erreichter Tumorfreiheit, insbesondere in frühen Erkrankungsstadien (AJCC I/II), aber auch nach bereits erfolgter Metastasierung (Stadium III/IV) in Betracht. Eine unlängst entwickelte Methode zur Prädiktion der Prognose bei Melanompatienten ist die so genannte „Sentinel Lymph Node Dissection”, die diagnostische Exstirpation des Schildwächter-Lymphknotens und nachfolgende sowohl konventionell histologische als auch immunhistologische Untersuchung des Exzidats. Es zeigte sich eine deutlich ungünstigere Prognose bei Patienten mit positivem Nachweis einer Mikrometastasierung des Sentinel Lymphknotens verglichen mit Patienten mit negativer Histologie [2]. Allerdings ist dieses Verfahren aufwändig und für den Patienten mit operativ-invasiven Maßnahmen verbunden. Einfacher, weniger invasiv und nicht zuletzt auch kostengünstiger wäre eine Prognoseeinschätzung mittels sensitiver löslicher Faktoren in Serum oder Plasma der Patienten. Eine derartige Untersuchung ließe sich auch beliebig oft zu späteren Zeitpunkten wiederholen.

Bekannte prognostische Serummarker des Melanoms

Verschiedenste lösliche Moleküle wurden bereits hinsichtlich ihrer prognostischen Relevanz beim malignen Melanom untersucht und beschrieben (siehe Tab. [1]). Als bekanntester und bereits als weitgehend etabliert einzustufender Marker ist das S100-β-Protein zu nennen. Die Serumkonzentration des S100-β wurde in verschiedenen Arbeiten als guter Indikator sowohl der Prognose [3] [4] als auch des Therapieverlaufes [5] bei Melanompatienten beschrieben. Ein Schwachpunkt des S100-β als prognostischer Marker ist die geringe prädiktive Wertigkeit bei Patienten in frühen Erkrankungsstadien (AJCC I/II) [3] [4]. Als weiterer ausführlich untersuchter Serummarker mit einer guten Korrelation zur Prognose kann das Melanoma Inhibitory Activity Protein (MIA) angesehen werden [6]. Im Gegensatz zu S100-β konnten hier auch bei Patienten in frühen Erkrankungsstadien vor erfolgter Metastasierung bereits erhöhte Serumwerte für MIA gefunden werden (13 % in AJCC Stadium I, 23 % in AJCC Stadium II), die mit einer erhöhten Progressionswahrscheinlichkeit dieser Patienten assoziiert waren [6]. Weitere Untersuchungen zeigten jedoch einen weitaus niedrigeren Anteil an Patienten mit erhöhten MIA-Serumwerten in einer vergleichbaren Patientengruppe (5,6 % in AJCC Stadium I/II) [7]. Ein nicht melanom-spezifischer, jedoch zur Vorhersage der Prognose von fernmetastasierten Melanompatienten (AJCC Stadium IV) gut geeigneter Serumfaktor ist die Laktat-Dehydrogenase (LDH) [8]. Dieser Marker zeigt eine starke Korrelation zur Tumorlast, ist jedoch zur Prognoseeinschätzung bei tumorfreien Patienten wenig geeignet.

Tab. 1 Prognostische Marker des malignen Melanoms: sHLA, sFas/CD95, IL-8

Marker	Literaturstelle	untersuchtes Medium	Anzahl der Patienten	Stadium (AJCC)	Anzahl der Kontrollen	Korrelation mit Gesamtüberleben	Korrelation mit progressionsfreiem Überleben
sHLA-DR	Rebmann et al. (2002) [15]	Serum	183	I/II/III/IV	86	+ (p = 0,021)	+ (p < 0,0005)
sHLA-I	Westhoff et al. (1998) [17]	Plasma	105	I/II/III/IV	55	n. t.	+ (p = 0,04)
sHLA-G	Ugurel et al. (2001) [22]	Serum	190	I/II/III/IV	126	- (p > 0,05)	- (p > 0,05)
sFas/CD95	Mouawad et al. (2000) [45]	Plasma	45	IV	34	n. t.	n. t.
	Ugurel et al. (2001) [46]	Serum	125	I/II/III/IV	30	+ (p < 0,005)	+ (p < 0,0005)
IL-8	Scheibenbogen et al. (1995) [55]	Serum	56	IV	30	n. t.	n. t.
	Ugurel et al. (2001) [56]	Serum	125	I/II/III/IV	30	+ (p < 0,00005)	+ (p < 0,00005)
Alle Untersuchungen wurden mittels ELISA-Technik durchgeführt; n. t.: nicht getestet

Lösliche HLA-Moleküle als prognostische Serummarker

Human leukocyte antigen(HLA)-Moleküle sind von herausragender Wichtigkeit für die Interaktion zwischen Tumorzellen und Effektorzellen des Immunsystems [9]. Tumorassoziierte Antigene, deren Erkennung durch antigenspezifische T-Lymphozyten essenziell für den Ablauf sowohl der humoralen als auch der zellulären antitumoralen Immunantwort ist, werden an der Oberfläche der Tumorzellen durch HLA-Moleküle präsentiert. Des Weiteren ist die Expression von HLA-Molekülen auf den verschiedenen lymphomonozytären Zelltypen von ebenso großer Bedeutung für die Immunabwehr der Tumorzellen, hier beispielsweise auf der Oberfläche professioneller antigenpräsentierender Zellen.

Lösliche Formen der HLA-Moleküle konnten bereits vor längerer Zeit im Serum und in anderen Körperflüssigkeiten gefunden werden [10] [11]. Diese löslichen HLA-Moleküle (sHLA) entstehen durch Abscherung membranständiger HLA-Moleküle von der Zelloberfläche (Shedding) oder durch zelluläre Sekretion und sind in der Lage, an die gleichen Liganden wie ihre membranständigen Dependants zu binden und über diese Bindung verschiedene Effekte, wie z. B. die Induktion einer Apoptose, auszuüben [12]. Lösliche HLA-Moleküle könnten somit im Serum sowohl ein Abbild der HLA-Zelloberflächen-Expression des Patienten darstellen als auch selbst immunmodulatorische Funktionen ausüben.

Lösliche HLA-Klasse-II-Antigene HLA-DR (sHLA-DR) konnten kürzlich als Serum-Indikator für den Status der Immun-Aktivierung eines Patienten beschrieben werden. So zeigten beispielsweise Patienten unter aktiver Virus-Infektion oder Graft-Versus-Host-Disease erhöhte Serum-Konzentrationen für sHLA-DR [13]. Dagegen wiesen Patienten mit reduzierter Immunabwehrfunktion, z. B. unter schwerer Sepsis, deutlich erniedrigte Serumwerte für sHLA-DR auf [14]. In einer größeren Untersuchung an 183 Melanompatienten unterschiedlicher Erkrankungsstadien fanden sich deutlich erniedrigte sHLA-DR-Serumwerte bei Patienten mit reduzierter Prognose (Abb. [1]) [15]. Im Gegensatz zu den gleichzeitig bei diesen Patienten gemessenen Serumwerten für S100-β fand sich insbesondere auch bei Patienten in frühen Erkrankungsstadien (AJCC I/II) eine starke Assoziation erniedrigter sHLA-DR-Serumkonzentrationen mit einer ungünstigen Prognose (Abb. [2]). sHLA-DR konnte in diesem Zusammenhang als unabhängiger prognostischer Faktor des progressionsfreien Überlebens bei Melanompatienten gezeigt werden (Abb. [3]). Vermutet und aktuell untersucht wird eine Funktion des sHLA-DR als Abbild einer erniedrigten Expression von HLA-DR-Molekülen auf Effektorzellen des Immunsystems und somit als Indikator einer verminderten Funktion der Antigen-Präsentation im Rahmen der antitumoralen Immunabwehr.

Abb. 1 sHLA-DR als Serummarker mit prädiktiver Wertigkeit für das progressionsfreie und das Gesamtüberleben von Melanompatienten. Kaplan-Meier-Kurven zur Darstellung des Gesamtüberlebens (a) und des progressionsfreien Überlebens (b) bei 183 Melanompatienten. Die Patienten wurden nach ihren Serumwerten für sHLA-DR in 2 Gruppen unterteilt (a = 75 Patienten, b = 108 Patienten); der verwendete Cut-off-Wert von 0,3 μg/ml wurde mittels ROC-Kurvenanalyse bestimmt. Die statistischen Signifikanzen, angegeben in der rechten oberen Bildecke, wurden mittels des Log-Rank-Tests bestimmt. Modifiziert aus: Rebmann et al. [1]) [15].

Abb. 2 sHLA-DR ermöglicht eine bessere prognostische Einschätzung des progressionsfreien Überlebens von AJCC-Stadium I/II Melanompatienten als S100-β. Kaplan-Meier-Kurven zur Darstellung des progressionsfreien Überlebens bei 60 Melanompatienten in frühen Erkrankungsstadien (AJCC I/II). Die Patienten wurden anhand ihrer Serumwerte für sHLA-DR (a) und S100-β (b) in 2 Gruppen unterteilt; der verwendete Cut-off-Wert von 0,3 μg/ml für sHLA-DR wurde mittels ROC-Kurvenanalyse bestimmt (siehe Abb. [1]), für S100-β wurde der vom Hersteller angegebene Cut-off-Wert von 0,12 μg/l verwendet. Die statistischen Signifikanzen, angegeben in der rechten unteren Bildecke, wurden mittels des Log-Rank-Tests bestimmt. Modifiziert aus: Rebmann et al. [15].

Abb. 3 sHLA-DR hat eine höhere prognostische Aussagekraft hinsichtlich des progressionsfreien Überlebens von Melanompatienten als S100-β. Receiver operating characteristic (ROC) Kurvenanalyse zur Sensitivität und Spezifität von sHLA-DR (a) im Vergleich zu S100-β (b) hinsichtlich der prädiktiven Wertigkeit für das progressionsfreie Überleben bei 183 Melanompatienten. Als optimaler Cut-off-Wert wurde für sHLA-DR 0,3 μg/ml bestimmt, für S100-β konnte kein Cut-off-Wert berechnet werden. Modifiziert aus: Rebmann et al. [15].

HLA-Klasse-I-Moleküle spielen eine bedeutende Rolle im Rahmen der antitumoralen Immunabwehr durch ihre antigenpräsentierende Funktion gegenüber zytotoxischen T-Lymphozyten. Ein kompletter oder teilweiser Verlust der HLA-Klasse-I-Expression auf malignen Zellen führt zu einer verminderten spezifischen Erkennung und Zerstörung dieser Zellen durch die Effektorzellen des Immunsystems [16]. Lösliche Formen klassischer HLA-Klasse-I-Moleküle (sHLA-I) wurden kürzlich in Plasmen von 105 Melanompatienten untersucht [17]. Hierbei ergab sich eine Assoziation erniedrigter Plasmawerte für sHLA-I mit erhöhter Tumoreindringtiefe und Metastasierung, jedoch nur eine schwache Korrelation zur Prognose der Patienten. Weitere Untersuchungen an größeren Patientenkollektiven sind in Planung, um die prädiktive Wertigkeit von sHLA-I bei Melanompatienten zu evaluieren.

Das nicht-klassische HLA-Klasse-I-Molekül HLA-G wurde ursprünglich als ausschließlich auf fetalen Zellen der Plazenta exprimiertes Protein beschrieben und hat eine zentrale Bedeutung für die Aufrechterhaltung einer immunprivilegierten Zone an der maternofetalen Grenzregion [18] [19]. Auch maligne entartete Zellen schaffen sich durch verschiedene Escape-Mechanismen ein immunprivilegiertes Umgebungsmilieu, so z. B. durch eine verminderte oder gänzlich fehlende Expression klassischer HLA-Klasse-I-Moleküle [16]. Hierdurch bieten diese Zellen wiederum einen Angriffspunkt für natürliche Killerzellen (NK-Zellen). Eine Expression von HLA-G an der Zelloberfläche würde die Tumorzellen vor einem NK-Zell-Angriff bewahren. So konnte kürzlich eine HLA-G-Expression für Melanomzellen nachgewiesen werden, die diese Zellen effektiv vor einer Lyse durch NK-Zellen schützte [20]. Lösliche HLA-G-Moleküle (sHLA-G) konnten bereits im Serum sowie in verschiedenen anderen Körperflüssigkeiten nachgewiesen werden [21]. In einer größeren Studie an 190 Melanompatienten unterschiedlicher Erkrankungsstadien fanden sich zwar erhöhte Serumwerte für sHLA-G in der Patientengruppe im Vergleich zur Kontroll-Gruppe sowie ein starker Einfluss einer systemischen Therapie mit Interferon(IFN)-α auf die sHLA-G-Serumkonzentration (Abb. [4 a]), jedoch keine Korrelation zur Überlebenswahrscheinlichkeit (Abb. [4 b]) [22]. sHLA-G ist somit keine potenzielle Funktion als prädiktiver Serummarker beim malignen Melanom zuzuordnen.

Abb. 4 Erhöhte sHLA-G-Serumspiegel bei Melanompatienten werden durch Therapie mit IFN-α induziert und sind ohne prognostische Relevanz. (a) sHLA-G-Serumkonzentrationen aus jeweils 10 repräsentativen Melanompatienten vor und unter laufender Chemotherapie bzw. IFN-α Immuntherapie. p < 0,005 für Differenzen vor/unter Therapie mit IFN-α, Student's t-Test für gepaarte Stichproben. (b) Kaplan-Meier-Kurven zur Darstellung des Gesamtüberlebens bei 190 Melanompatienten. Die Patienten wurden nach ihren Serumwerten für sHLA-G in 2 Gruppen unterteilt; der verwendete Cut-off-Wert von 27,45 ng/ml wurde mittels ROC-Kurvenanalyse bestimmt. Die statistische Signifikanz, angegeben in der rechten oberen Bildecke, wurde mittels des Log-Rank-Tests bestimmt. Modifiziert aus: Ugurel et al. [22].

Lösliches Fas/CD95 (sFas) als prognostischer Serummarker

Apoptose-Mechanismen, deren Ziel der so genannte „programmierte Tod” der Zelle darstellt, spielen eine bedeutende Rolle für die Proliferation und Immunabwehr maligner Tumoren [23]. Sowohl die Effizienz der zellulären antitumoralen Immunantwort als auch die Wirksamkeit zahlreicher Zytostatika basieren essenziell auf einer hinreichenden Funktion der die Apoptose auslösenden Signalwege. Das Fas/CD95-FasLigand(FasL)-System spielt in diesem Zusammenhang eine entscheidende Rolle als Angriffspunkt der zellulären Immunabwehr, z. B. der zytotoxischen CD8⁺ T-Lymphozyten [24]. Fas/CD95 ist ein membranständiges Rezeptormolekül, das zu der Familie der so genannten Todesrezeptoren gehört. Durch Bindung des FasL-Moleküls wird eine Quervernetzung mehrerer Fas/CD95-Rezeptormoleküle hervorgerufen, die eine Signaltransduktion in das Zellinnere auslöst, in deren Folge es durch Ablauf einer enzymatischen Kaskade zum Tod der Zelle kommt [23] (Abb. [5]). Für Tumorzellen unterschiedlicher Herkunft wurde eine verminderte Expression oder gestörte Funktion der Fas/CD95-Expression beschrieben [25] [26]. Bezogen auf das maligne Melanom konnte eine besonders stark ausgeprägte Dysfunktion des Fas/CD95-FasL-Systems nachgewiesen werden [27] [28] [29] [30] [31], für die eine wichtige Bedeutung für den Metastasierungsprozess gezeigt werden konnte [32]. Wie auch für andere Rezeptormoleküle bekannt existieren auch im Falle des Fas/CD95 lösliche Molekülformen, denen der transmembranäre Anteil fehlt [33]. Diese entstehen jedoch im Falle des Fas/CD95 im Gegensatz zu anderen Rezeptormolekülen nicht durch Abscherung membranständiger Moleküle von der Zelloberfläche (Shedding), sondern durch alternatives Splicing und anschließende Sekretion durch die Zelle [34]. Diese löslichen Fas/CD95 Moleküle (sFas) sind in der Lage, durch Bindung an FasL Moleküle diese für eine weitere Bindung an membranständige Fas/CD95-Rezeptormoleküle zu blockieren [33] (Abb. [5]). Die FasL tragenden Effektorzellen, z. B. CD8⁺-zytotoxische T-Lymphozyten, sind somit hinsichtlich ihrer Fähigkeit, in Fas/CD95-tragenden Zielzellen eine Apoptose auszulösen, deutlich eingeschränkt. Erhöhte Serumwerte für sFas konnten erstmals bei Patienten mit aktiven Autoimmunerkrankungen nachgewiesen werden [35]. Wenig später wurden bei Patienten mit malignen Erkrankungen ebenfalls erhöhte Serumwerte für sFas beschrieben [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44], die in einigen Fällen eine Korrelation mit der Prognose der Patienten aufwiesen [36] [39] [40] [42] [43] [44]. Innerhalb eines größeren Kollektivs von Tumorpatienten mit unterschiedlichen Neoplasien wurden erstmals 8 Patienten mit malignem Melanom untersucht, die im Vergleich zu gesunden Kontroll-Probanden erhöhte sFas-Serumkonzentrationen aufwiesen [36]. In einer weiteren Untersuchung zeigten sich erhöhte sFas-Konzentrationen in Plasma von 45 Melanompatienten im fernmetastasierten Stadium (AJCC IV) [45]. Eine größere Studie an 125 Melanompatienten unterschiedlicher Erkrankungsstadien ergab deutlich erhöhte Serumkonzentrationen für sFas bei Melanompatienten im Vergleich zu 30 untersuchten gesunden Kontroll-Probanden [46]. Die erhöhten Serumwerte zeigten eine starke Korrelation zu fortgeschrittenen Erkrankungsstadien, jedoch nur eine schwache Assoziation zu nachweisbarer Tumorlast der Patienten. Des Weiteren fanden sich deutlich erhöhte sFas-Serumkonzentrationen bei Patienten mit ungünstiger Prognose (Abb. [6]). sFas konnte im Rahmen dieser Studie als unabhängiger prognostischer Faktor für das progressionsfreie Überleben der Patienten gezeigt werden. Weitere Untersuchungen sind geplant, insbesondere zur Analyse der Herkunft der löslichen Fas-Moleküle bei Patienten mit malignem Melanom.

Abb. 5 Lösliche Fas-Moleküle (sFas) blockieren die Fas-vermittelte Induktion der Apoptose in Melanomzellen. (A) Fas-Ligand(FasL)-tragende zytotoxische T-Lymphozyten sind durch Bindung an den Fas-Rezeptor (Fas) auf der Oberfläche von Melanomzellen in der Lage, diese durch Auslösung einer enzymatischen Kaskade in den Tod durch Apoptose zu treiben. (B) Von Melanomzellen sezernierte lösliche Fas-Moleküle (sFas) blockieren FasL-Moleküle auf der Oberfläche zytotoxischer T-Lymphozyten und verhindern somit die Induktion einer Fas-vermittelten Apoptose in Melanomzellen.

Abb. 6 sFas als Serummarker mit prädiktiver Wertigkeit für das progressionsfreie und das Gesamtüberleben von Melanompatienten. Kaplan-Meier-Kurven zur Darstellung des Gesamtüberlebens (a) und des progressionsfreien Überlebens (b) bei 125 Melanompatienten. Die Patienten wurden anhand ihrer Serumwerte für sFas in 2 Gruppen unterteilt; der verwendete Cut-off-Wert von 7,92 ng/ml wurde mittels ROC-Kurvenanalyse bestimmt. Die statistischen Signifikanzen, angegeben in der rechten oberen Bildecke, wurden mittels des Log-Rank-Tests bestimmt. Modifiziert aus: Ugurel et al. [46].

Interleukin-8 (IL-8) als prognostischer Serummarker

Interleukin-8 (IL-8), zugehörig zur Gruppe der CXC-Chemokine, ist bekannt für seine pro-inflammatorische [47] sowie pro-angiogenetische [48] Wirkung. Bezogen auf das maligne Melanom konnte IL-8 bereits vor einiger Zeit als autokriner Wachstumsfaktor beschrieben werden [49]. Eine Rolle der IL-8-Expression für die Progression und Metastasierung des Melanoms ist wahrscheinlich [50] [51] [52] [53] [54]. Eine erste Untersuchung der IL-8-Serumkonzentration bei 56 Melanompatienten zeigte erhöhte Werte bei Patienten im Vergleich zu gesunden Kontroll-Probanden sowie eine Korrelation der IL-8-Serumwerte mit der Tumorlast der Patienten [55]. In einer größeren Studie an 125 Melanompatienten fand sich eine Korrelation der IL-8-Serumkonzentration zu Erkrankungsstadium und Tumorlast der Patienten [56]. Hinsichtlich der Prognose der Patienten konnte IL-8 in dieser Arbeit als unabhängiger prädiktiver Faktor sowohl für das progressionsfreie Überleben als auch für das Gesamtüberleben der Patienten dargestellt werden (Abb. [7]). Erhöhte Serumwerte für IL-8 wurden hier jedoch ausschließlich in Patienten mit metastasierter Erkrankung detektiert. IL-8 stellt somit einen guten prädiktiven Marker für fortgeschrittene Erkrankungsstadien (AJCC III/IV), nicht jedoch für die frühen Stadien der Melanomerkrankung (AJCC I/II) dar.

Abb. 7 Interleukin-8 (IL-8) als Serummarker mit prädiktiver Wertigkeit für das progressionsfreie und das Gesamtüberleben von Melanompatienten. Kaplan-Meier-Kurven zur Darstellung des Gesamtüberlebens (a) und des progressionsfreien Überlebens (b) bei 125 Melanompatienten. Die Patienten wurden anhand ihrer Serumwerte für IL-8 in 2 Gruppen unterteilt; der verwendete Cut-off-Wert von 226,8 pg/ml wurde mittels ROC-Kurvenanalyse bestimmt. Die statistischen Signifikanzen, angegeben in der rechten oberen Bildecke, wurden mittels des Log-Rank-Tests bestimmt. Modifiziert aus: Ugurel et al. [56].

Diskussion und Ausblick

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass eine sinnvolle Selektion hinreichend sensitiver prognostischer Serummarker für das maligne Melanom weiterführender Untersuchungen hinsichtlich der Wertigkeit und Durchführbarkeit bedarf. Möglicherweise ist für eine genauere Einschätzung der Prognose eines Patienten ein einzelner Marker nicht ausreichend, sondern die Vorhersagekraft durch die Kombination mehrerer Marker deutlich steigerbar. Insbesondere für Patienten in frühen Erkrankungsstadien vor Nachweis einer Metastasierung bedarf es hinreichend sensitiver und weitläufig einsetzbarer prognostischer Marker, um so identifizierte Risiko-Patienten weiterführenden diagnostischen und/oder therapeutischen Maßnahmen zuzuführen.

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