Microarray-Analysis: A New Approach to Study the Molecular Mechanisms of Thermo-Chemotherapy

Zusammenfassung

Hintergrund: Die Kombination von Hyperthermie und Chemotherapie (Thermo-Chemotherapie) gehört zu den experimentellen klinischen Therapieansätzen in der Behandlung von Patienten mit rezidiviertem Neuroblastom. In verschiedenen In-vitro-Modellen konnte ein verstärkender Effekt der Hyperthermie auf die zytotoxischen Effekte von Alkylantien und Platinderivaten bereits nachgewiesen werden. Über die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen ist allerdings bisher wenig bekannt. Methode: Um erste Einblicke in Pharmakogenomik und mögliche Zielgene der Thermo-Chemotherapie zu erhalten, behandelten wir als Modell die humane Neuroblastom-Zelllinie LAN 1 mit Cisplatin in niedriger Dosierung allein, unter simultaner Erwärmung auf 42 °C oder mit Hyperthermie allein. Die Zellen wurden jeweils für 1 h behandelt. Anschliessend wurden an 5 Zeitpunkten zwischen 0 und 24 h nach Behandlung RNA-Extrakte hergestellt und die Expressionshöhe von 12 000 Genen mit U95Av2 Oligonukleotid-Arrays (Affymetrix Inc.) gemessen. Signifikante Veränderungen der Genexpressionshöhe wurden mit Ähnlichkeitsmatrizen und Korrrelationsanalysen berechnet. Ergebnisse: Nach Behandlung von LAN-1-Zellen mit niedrig dosiertem Cisplatin allein kam es zu signifikanten Veränderungen in der Expressionshöhe von nur 23 Genen. Unter alleiniger Hyperthermie ließen sich signifikante Veränderungen der Expressionshöhe bei 136 Genen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen beobachten. Die Kombinationsbehandlung von Cisplatin und Hyperthermie führte zu einer signifikanten Änderung der Expression von 251 Genen. In dieser Gruppe fanden sich interessanterweise 131 Gene, deren Expression sich unter Behandlung mit Cisplatin oder Hyperthermie allein nicht verändert hatte. Diese Ergebnisse werden nun auf mRNA- und Proteinebene durch RT-PCR und Western-Blot-Analyse validiert. Schlussfolgerung: Microarray-Analyse ist eine neue Methode, die sich zur Identifizierung von Genen eignet, die für den synergistischen Effekt von Hyperthermie und Chemotherapie auf Tumorzellen eine wichtige Rolle spielen könnten.

Abstract

Background: Experimental studies for the treatment of relapsed neuroblastoma include the use of hyperthermia in combination with chemotherapeutic drugs. Cytotoxic effects of alkylants and platinum compounds on tumor cells can be enhanced by hyperthermia in various in vitro models. However, the underlying molecular mechanisms are still largely unknown. Method: In this study, we used microarray-analysis as a new biological approach to gain insight into the pharmacogenomics and possible target genes of thermochemotherapy. As a model, LAN 1 neuroblastoma cells were treated for 1 h with low doses of cisplatin alone, with simultaneous heating to 42 °C or with hyperthermia alone. Gene expression was analyzed at five time points 0 to 24 h after treatment using U95Av2 oligonucleotide arrays (Affymetrix Inc). Significant changes of gene expression levels were calculated by similarity metrices and Pearson correlation. Results: Only a few genes (n = 23) demonstrated altered expression following treatment of LAN 1 cells with cisplatin alone. Hyperthermia alone resulted in significant expression changes of 136 genes in comparison to untreated control cells. Combination therapy of cisplatin and hyperthermia resulted in expression changes of 251 genes, interestingly including 131 genes with unchanged expression under treatment with either cisplatin or hyperthermia alone. Significant changes of expression levels could be annotated to genes involved in heat shock response, protein degradation and apoptosis. These results are now being validated on mRNA- and protein levels by RT-PCR and Western Blot analysis. Conclusion: Microarray-Analysis is a suitable new approach for the identification of target genes, which might play an important role for the synergistic effect of hyperthermia and chemotherapy in tumor cells.

Schlüsselwörter

Hyperthermie - Thermochemotherapie - Neuroblastom - Microarrays - Expressionprofile - Cisplatin

Key words

Hyperthermia - thermochemotherapy - neuroblastoma - microarray - expression profiling - cisplatin

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