Die Haut stellt als Zielorgan des Gentransfers ein attraktives Gewebe zur Entwicklung
neuartiger Behandlungsmöglichkeiten für eine große Anzahl unterschiedlicher Erkrankungen
dar. Hierzu zählt die genetische Immunisierung gegen Krebs oder Infektionskrankheiten,
die Förderung der Wundheilung sowie die kausale Behandlung monogen vererbter Genodermatosen
als auch systemischer Proteinmangelerkrankungen wie Hämophilie [1]
[2]
[3]
[4]. Darüber hinaus bietet die Haut gerade im Vergleich zu anderen häufig zum Gentransfer
avisierten Organen wie Leber, Blutzellen und Muskel den Vorteil der leichten Erreichbarkeit
und Einsehbarkeit, was eine unproblematische Entnahme von Hautzellen erlaubt, die
einmalige Situation der ständigen Kontrollierbarkeit gentherapeutisch veränderten
Gewebes und im Falle von Nebenwirkungen die Option einer schnellen und gezielten Exzision
des betroffenen Hautareals.
In Abhängigkeit von der Erkrankung, die durch genetische Modulation behandelt werden
soll, muss die Applikation einer Genfähre (Vektor) bestimmte Anforderungen erfüllen,
beispielsweise bezüglich der Effizienz des Gentransfers, der gewünschten Dauer der
Genexpression, der Spezifität des zu transfizierenden Zelltyps und vor allem der Sicherheit.
Da die „perfekte Genfähre” bisher noch nicht existiert, ist die Entwicklung eines
möglichst effizienten und sicheren Vektors nach wie vor eine der größten Herausforderungen
und Aufgaben auf dem Gebiet der Gentherapie.
Eines der viel versprechenden Vektorsysteme, welches bereits in ersten humanen Studien
zur Behandlung von Hämophilie und Zystischer Fibrose zum Einsatz kam, basiert auf
dem rekombinanten adeno-assoziierten Virus Typ 2 (rAAV-2) [5]. Die Vorteile von rAAV-2 als Vektor liegen unter anderem im breiten Tropismus, was
eine effiziente Transduktion einer Vielzahl unterschiedlicher Zelltypen erlaubt, im
Potenzial zur Langzeitgenexpression und spezifischen Integration sowie in der niedrigen
Immunogenität.
Vom Virus zum Vektor
Vom Virus zum Vektor
Wildtyp-AAV-2 wurde Mitte der 60er-Jahre als Verunreinigung bei der Laborherstellung
von Adenoviren entdeckt. AAV-2 sind einzelsträngige, hüllenlose DNS-Viren aus der
Familie der Parvoviridae
[5]
[6]
[7]
[8]. Da sie natürlich Replikations-defizient sind, gehören sie dem Genus Dependovirus an. Zur AAV-2-Replikation bedarf es in der Wirtszelle zusätzlicher viraler Kofaktoren,
die beispielsweise von Adenoviren oder Herpesviren bereit gestellt werden. In Abwesenheit
dieser Helferfunktion integriert Wildtyp-AAV-2 in bis zu 70 % an einer spezifischen
Stelle (AAV-S1) in Chromosom 19q13.3-qter. Die Integration von Therapiegenen an dieser
Stelle wird als ungefährlich angesehen, was eine wünschenswerte Voraussetzung für
einen Langzeitgentransfer darstellt. Als humaner Virus, dessen primärer Wirt der Mensch
ist, scheint AAV als Vektor zur Gentherapie sehr geeignet, da bisher keine Erkrankungen
bekannt geworden sind, die bei einer Seropositivität in der erwachsenen Bevölkerung
bis zu 70 % auf eine Infektion mit AAV-2 zurückzuführen sind. Neben AAV-2 sind sieben
weitere Serotypen bekannt [8].
Das Genom von AAV-2 besteht aus 4680 Nukleotiden, die zwei offene Leserahmen beinhalten,
welche für die Replikations- (Rep) und Kapsidproteine (Cap) kodieren. Flankiert werden
sie zu beiden Seiten von invertierten terminalen Repetitionen (ITR). Die ITRs sind
die einzigen in cis notwendigen Virus-eigenen DNS-Sequenzen, die zur Herstellung rekombinanter Vektorpartikel
notwendig sind und erhalten werden müssen. Die gesamten kodierenden Virussequenzen
(Rep und Cap) können durch eine Expressionskassette ersetzt werden, in die ein beliebiges
Therapiegen eingebaut werden kann. Zur Herstellung von rekombinanten Vektorpartikeln
werden Rep und Cap und die darüber hinaus notwendigen adenoviralen Kofaktoren in trans zur Verfügung gestellt [9]. Damit eine effiziente Herstellung von rekombinanten Vektorpartikeln gewährleistet
ist, darf das Therapiegen mit allen notwendigen regulatorischen Sequenzen wie Promotor
und Poly-A-Bereich zusätzlich beider ITRs die Länge des Wildtypvirus nicht wesentlich
überschreiten [10]. Auf diese Weise können Vektor-Lysate mit Titern > 1010 infektiösen Partikeln/ml hergestellt werden [9].
Allgemeine Aspekte des rAAV-2 vermittelten Gentransfers in Keratinozyten
Allgemeine Aspekte des rAAV-2 vermittelten Gentransfers in Keratinozyten
Da Keratinozyten eine wesentliche Rolle in der Pathophysiologie von zahlreichen Hauterkrankungen
spielen, insbesondere bei unterschiedlichen Genodermatosen, Hautkrebs oder der Wundheilung,
kommt dem Gentransfer in Keratinozyten eine besondere Bedeutung zu.
In einer von der Berliner Dermatologischen Gesellschaft mit ihrem Forschungsförderpreis
2000 ausgezeichneten Arbeit wurde erstmals aufgezeigt, dass rAAV-2-Vektoren einen
effizienten Gentransfer in humanen Keratinozyten in vitro grundsätzlich ermöglichen [11]. An einem Schweinemodell konnte dies in vivo von Hengge und Mirmohammadsadegh bestätigt werden, wo sich nach intradermaler Injektion
von rAAV-2-Partikeln eine Expression des Transgens in der Epidermis und in Haarfollikelzellen
bis zu 6 Wochen nachweisen ließ [12]. Außer Keratinozyten ließen sich in der Haut noch Zellen melanozytären Ursprungs
effizient transduzieren [13].
In der Folge fiel auf, dass die relative Permissivität von Keratinozyten für rAAV-2
im Vergleich zu den sehr stark rAAV-2-permissiven HeLa-Zellen deutlich erniedrigt
ist. Dies zeigte sich vor allem nach Verwendung von Vektor-Lysaten, die nach einer
neu entwickelten, vollständig Adenovirus-freien rAAV-2-Herstellungsmethode aufbereitet
waren und den bekannten Effekt der Transduktionserhöhung durch kontaminierende Adenoviren
vermissen ließen [9]. Aus dieser Problematik ergaben sich die Fragen, welche Faktoren Einfluss auf die
rAAV-2-Transduktion von Keratinozyten nehmen und die relativ niedrige Permissivität
erklären könnten bzw. durch welche Faktoren sich die Transduktionseffizienz bei Keratinozyten
erhöhen ließe.
Betrachtet man den Infektionsweg von AAV-2 [6], so steht an erster Stelle die Virusaufnahme in die Zelle. Bei AAV-2 ist diese Rezeptor-vermittelt.
Da Keratinozyten sowohl die notwendigen Primärrezeptoren (Heparansulfatproteoglykane)
als auch Korezeptoren (FGF-R, Integrin) auf ihrer Oberfläche exprimieren, erscheint
es primär unwahrscheinlich, dass die Zellaufnahme gestört ist. Nach Rezeptor-vermittelter
Endozytose werden die Viruspartikel innerhalb des Zytoplasmas in Endosomen zum Nukleus
transportiert, wo sie in den Perinuklearraum freigegeben werden. Bei Keratinozyten
zeigte sich wie auch bei anderen Zellarten, dass Virione auf diesem intrazellulären
Transportweg durch Proteasomen abgebaut werden bzw. durch Inhibition der Proteasomenaktivität
eine deutliche zumindest temporäre Erhöhung der Transduktionseffizienz zu erzielen
ist [14]
[15]
[16]. Nach der Aufnahme in den Nukleus muss die einsträngige Virus- bzw. Vektor-DNS in
eine doppelsträngige transskriptionsaktive DNS synthetisiert werden, damit eine Genexpression
zustande kommt. Eine entscheidende Rolle spielt dabei der Phosphorylierungszustand
eines zellulären Proteins namens Einzelstrang D-Sequenz-Bindungsprotein (ssD-BP),
der wiederum durch die Tyrosinphosphokinase des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors
beeinflusst (EGF-R TK) wird [17]. Da EGF für das Wachstum von Keratinozyten wichtig ist, war zu erwarten, dass EGF-R
TK bei Keratinozyten die Transduktion beeinflusst. Dementsprechend konnte eine mehrere
Wochen anhaltende Erhöhung der Genexpression durch Blockierung von EGF-R TK erwirkt
werden [16].
Da sowohl Proteasomen-Inhibitoren als auch EGF-R TK-Inhibitoren als Medikamente in
klinischer Anwendung sind, könnten sie künftig zu einer Optimierung der rAAV-2-Transduktion
von Keratinozyten herangezogen werden.
Anwendungsbereiche von rAAV-2-Vektoren in der Hautgentherapie
Anwendungsbereiche von rAAV-2-Vektoren in der Hautgentherapie
Die Förderung der Wundheilung durch Wachstumsfaktoren erfährt zunehmendes Interesse
innerhalb der letzten Jahre. Nachdem man die regulatorischen Funktionen von mehreren
Wachstumsfaktoren in den unterschiedlichen Wundheilungsstadien erkannt hat, wurden
die Einzelsubstanzen auf ihr Potenzial zur Förderung der Wundheilung ausgetestet.
Dies führte beispielsweise zur Markteinführung von topisch applizierbarem rekombinanten
Blutplättchen-abstammenden Wachstumsfaktor PDGF (Becaplermin-Gel). Der Nachteil der
topischen Applikation von Wachstumsfaktoren ist jedoch deren kurze Halbwertszeit,
der schnelle Abbau im Wundsekret und deren schlechte Bioverfügbarkeit aus den verwendeten
Grundlagen. Eine Möglichkeit, die Dauer und Effizienz zu erhöhen, wäre der direkte
Gentransfer von Wachstumsfaktoren in das Wundbett [2]. In diesem Zusammenhang wurden rAAV-2-Vektoren bereits an unterschiedlichen Tiermodellen
mit Erfolg eingesetzt. So führte der Gentransfer von vaskulärem endothelialen Wachstumsfaktor
VEGF zur Stimulation der Angiogenese und zu einer verkürzten Heilungsphase bei Inzisions-,
Exzisions- und Verbrennungswunden [18]
[19]
[20].
Ein anderes Anwendungsgebiet könnten Erbkrankheiten sein. Da rAAV-2-Vektoren zumindest
theoretisch das Potenzial zur Integration des Transgens in die chromosomale DNS der
Zielzelle aufweisen und in einigen Tiermodellen bereits einen Langzeitgentransfer
von mehr als einem Jahr vermittelten, scheinen sie zur Therapie von Genodermatosen,
bei denen eine langfristige Korrektur erwünscht ist, geeignet [5]
[6]
[7]
[8]. Für einen Langzeitgentransfer an der Haut ist zusätzlich entscheidend, dass Keratinozytenstammzellen
stabil transduziert werden können. Nur so ist gewährleistet, dass das Therapiegen
im Kompartiment der ständigen Epidermiserneuerung verankert bleibt und nicht innerhalb
einer epidermalen Regenerationsphase von ca. 28 Tagen verloren geht [4]. Obwohl Keratinozytenstammzellen auf unterschiedliche Weise charakterisiert werden
können, existiert keine definitive Nachweismethode. Eine der Möglichkeiten besteht
in der Überprüfung der klonalen Wachstumseigenschaften von Keratinozyten in vitro [21]. Abb. [1] gibt ein Beispiel eines aus transfizierten Keratinozyten herangewachsenen Klons.
Hieraus lässt sich mutmaßen, dass rAAV-2-Vektoren Keratinozyten mit Stammzell-artigem
Wachstumsverhalten transduzieren können. Eine letztlich zuverlässige Aussage wird
jedoch erst nach Transplantation modifizierter Stammzellen in vivo möglich sein.
Abb. 1 Klonartig herangewachsenes Zellkonglomerat aus Keratinozyten, in die 11 Tage vorher
mit rAAV-2-Vektoren die cDNS für grün fluoreszierendes Protein eingebracht wurde (a Überblick mit 100 x, b Detail mit 400 x).
Welche Genodermatosen kommen für eine Gentherapie mittels rAAV-2-Vektoren in Betracht?
Grundsätzlich jede, deren Gendefekt bekannt ist und deren funktionelle DNS die Verpackungskapazität
des Vektors nicht überschreitet. Berechnet man für regulatorische Elemente ca. 2000
Basenpaare, ließen sich Therapiegene bis zu einer Größe von ca. 2500 Basenpaaren in
den Vektor einbauen. Eine Auswahl von Genodermatosen, die diese Voraussetzung erfüllen,
ist in Tab. [1] gegeben.
Tab. 1 Geeignete Genodermatosen für rAAV-2-vermittelte Gentherapie [mod. n. 5]
| Genodermatose |
Gendefekt |
Funktionale cDNS-Länge (Nukleotide) |
| x-chromosomale Ichthyose |
Steroidsulfatase |
1550 |
| Lamelläre Ichthyose |
Transglutaminase 1 |
2450 |
| Sjögren-Larsson Syndrom |
Fettaldehyddehydrogenase |
1550 |
| Junktionale Epidermolysis bullosa |
Laminin 5-γ2 Kette (LAMC2) |
1900 (verkürzt) |
| Ehlers-Danlos Typ VI |
Lysylhydroxylase 1 |
2100 |
| Refsum Syndrom |
Phytanoyl-CoA Hydroxylase |
1050 |
| Morbus Gaucher |
Glukozerebrosidase |
1650 |
| Papillon-Lefevre/Haim-Munk Syndrom |
Cathepsin C |
1900 |
| Albinismus Typ I |
Tyrosinase |
1600 |
| Kongenitale erythropoetische Porphyrie |
Uroporphyrinogen III Synthase |
1300 |
| Xeroderma pigmentosum |
XP-A, -B, -C, -D |
910, 2400, 2500, 2400 |
Die eigene Arbeit hat sich auf das Sjögren-Larsson Syndrom (SLS) konzentriert. SLS
ist eine autosomal-rezessiv vererbte, neurokutane Krankheit, die klinisch durch die
Trias kongenitale Ichthyose, mentale Retardierung und Spastik bis hin zur Di- oder
Tetraplegie charakterisiert ist [22]. Der dem Krankheitsbild zugrunde liegende Defekt befindet sich im Gen für Fettaldehyddehydrogenase
(FALDH) [23]. FALDH ist ein Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD)-abhängiges Enzym, welches als
Bestandteil des Fettalkohol:NAD+ Oxidoreduktase-Komplexes (FAO) für die Oxidation
präferentiell langkettiger aliphatischer Aldehyde zu Fettsäuren notwendig ist [23]. Bei SLS liegt ein Mangel an FALDH mit einer Enzymaktivität unter 10 % der Norm
vor. Die Behandlung ist bisher rein symptomatisch. Lediglich eine Therapie mit Leukotrien
B4-Synthese-Inhibitor Zileuton zeigte einzelne positive Effekte [24]. Die grundsätzliche Frage, ob rAAV-2-Vektoren eine Reexpression des funktionellen
Gens für FALDH in defekten Zellen erlauben, wurde bereits in einer FALDH-mutierten
Hamsterzelllinie bearbeitet. Dort konnte die FALDH-Aktivität von ursprünglich unter
10 % der Norm nach Gentransfer der funktionellen FALDH-Sequenzen in defekten Zellen
auf normales Niveau angehoben werden [25]. Vorläufige Daten an Keratinozyten von SLS-Patienten bestätigen eine Anhebung zumindest
auf das Niveau von heterozygoten Merkmalsträgern, die phänotypisch unauffällig sind.
Im Rahmen dieser Versuche scheinen rAAV-2-Vektoren das Potenzial zur genetischen Wiederherstellungstherapie
bei SLS zu haben. Ungeklärt bleibt jedoch, bei SLS wie auch bei allen weiteren Genodermatosen,
welcher Applikationsweg der viel versprechendste ist. Ist es beispielsweise möglich,
genetisch modizifierte Keratinozytenstammzellen dauerhaft zu transplantieren, und
wenn ja, wieviel Hautoberfläche muss transplantiert werden, bis sich ein therapeutischer
Nutzen einstellt? Oder wird ausschließlich ein direkter In-vivo-Gentransfer hilfreich sein? Würde der Gentransfer über die Haut auch zu einer systemischen
Verteilung von FALDH führen und könnten dadurch die neurologischen und systemischen
Defizite bei SLS abgemildert werden ?
Die letzte Frage zieht das Konzept mit ein, die Haut als „Biorektor” zur Therapie
von systemischen Enzym-Mangelerkrankungen nutzen zu wollen [26]. Hierbei würde ein Gen, dessen Genprodukt systemisch reduziert ist, in der Haut
überexprimiert, von dort sezerniert und über die Blutzirkulation verteilt. Die prinzipielle
Funktionalität dieses Konzeptes konnte bereits in einzelnen Tiermodellen beispielsweise
zur Therapie der Hämophilie aufgezeigt werden, jedoch noch nicht unter Verwendung
von rAAV-2-Vektoren.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass rAAV-2 durchaus als Vektor zur Hautgentherapie
geeignet erscheint. In den entsprechenden Modellen konnten sowohl Effekte zur Förderung
der Wundheilung als auch zur Genrekonstitution von Genodermatosen am Beispiel von
SLS erzielt werden. Obwohl die Forschungstätigkeit nach wie vor auf die Überprüfung
der prinzipiellen Funktionalität ausgerichtet und modellhaft ist, motivieren die Ergebnisse
zur Weiterentwicklung der Konzepte. Unabhängig von der Wahl des Vektorsystems müssen
jedoch in den kommenden Jahren speziell zur Gentherapie von Genodermatosen weitere
grundlegende Fragestellungen bearbeitet werden, wie das Problem der Immunantwort auf
Vektor oder Genprodukt, die gezielte Integration von Fremd-DNS an spezifischen Stellen
im Chromosom zur Vermeidung einer insertionellen Mutagenese, der gezielte Gentransfer
in Keratinozytenstammzellen in vivo oder die Entwicklung geeigneter Transplantationsverfahren zur dauerhaften Akzeptanz
ex vivo-modifizierter Stammzellen im Epidermis- bzw. Haarfollikelverbund.
