Noninvasive Prenatal Test Raises Concern Over Screening Strategies and the Role of Ultrasound

Several weeks ago a flyer announcing a “summer sale” for noninvasive prenatal testing (NIPT) at significantly reduced rates was distributed throughout Switzerland. The use of this term in connection with a novel prenatal diagnostic method for Down’s syndrome and other trisomies that continues to pose new challenges in this sensitive field is highly unusual and vexing.

Aggressive marketing in prenatal medicine is new and unusual in this part of the world and has been rejected in particular by US professional organizations [1]. While price reductions may be good news, a responsible approach following basic ethical rules in this sensitive context is more than desirable. There are still fundamental concerns including test performance as well as ethical aspects which need to be broadly discussed and resolved by consensus.

For decades, ultrasound screening has been offered as part of prenatal care in particular to detect multiples, growth disturbances, maternal risks such as preeclampsia, anomalies of placentation as well as placental location, and fetal malformations. The rate of severe congenital anomalies is around 3 – 4 % with about 1 % being chromosomal disorders. Prenatal chromosome testing of amniotic fluid cells retrieved by amniocentesis from 16 weeks of gestation onwards was introduced in the 1970s. In the 1980s chorionic villus sampling (CVS) performed from 11 weeks of gestation onwards became established as an earlier screening method. Randomized trials revealed a procedure-related pregnancy loss rate of 0.5 – 1 % for both approaches. For many years advanced maternal age was the main indication for fetal karyotyping. Since more than 30 % of all mothers are now 35 years or older in most industrialized countries, improved screening parameters have been established.

The measurement of the fetal nuchal translucency (NT) between 11 + 0 and 13 + 6 weeks of gestation provides the best discrimination between pregnancies with trisomy 21 or other aneuploidies and non-affected fetuses. Large prospective multicenter trials confirmed a detection rate of approximately 90 % with an FPR of 5 % for trisomy 21. This “combined test” includes NT, maternal serum markers, such as free ß-hCG and pregnancy-associated plasma protein A (PAPP-A), and maternal age [2] [3].

Additional sonographic findings such as the absence of the nasal bone, tricuspid valve insufficiency, and an abnormal blood flow in the ductus venosus increase the sensitivity or lower the false-positive rate [2] [4].

The exclusive consideration of maternal age prior to invasive testing no longer meets current diagnostic standards. This also applies to serum marker screening (the so-called triple test) in the second trimester with the exception of rare late pregnancy confirmation.

Therefore, professional organizations in many countries support a combined test according to the recommendations of the Fetal Medicine Foundation (FMF) UK and the FMF Germany [2] [3] [5]. Using different algorithms for individual risk calculations, both approaches integrate standardized quality assurance requirements for NT measurement which is technically challenging and highly dependent on the experience of the operator. For risk calculations the use of NT measurements not meeting the recognized quality criteria is discouraged and sufficient qualification including annual renewal of certification is required.

The rate of invasive procedures dropped by approximately 50 % after the introduction of the combined test during the last decade, while the detection rate increased to 90 %. This has been confirmed in single centers as well as by reports from countries with an established screening program, e. g. Denmark [6].

On the downside, even 10 years after the broad introduction of the so-called first trimester test, significant effort is still required to secure standardization of NT measurement, which is error-prone and operator-dependent and requires dedicated training in addition to the regular curriculum. Moreover, continuous supervision by an expert panel with an annual audit for recertification seems mandatory but entails a substantial organizational expenditure.

For decades some research groups have pursued the vision of a noninvasive method for detecting fetal chromosomal disorders in the maternal blood. For many years they focused on fetal cells (nucleated erythrocytes and trophoblast cells) in order to test for common aneuploidies in a simple maternal blood sample. An NIH-sponsored collaborative trial, however, provided ample evidence that this approach was unsuitable for routine testing [7]. The demonstration of cell-free fetal DNA fragments in maternal plasma more than ten years ago and the later availability of high throughput sequencing at affordable costs finally led to a breakthrough in NIPT. Most published case series included pregnancies at increased risk for chromosome anomalies and tested for trisomies 21, 13, and 18. Cell-free fetal DNA is also successfully used for noninvasive Rhesus testing and sex determination in cases of sex-specific disease risks.

The analysis is based on the quantification of chromosome-specific DNA fragments in maternal plasma [8]. The percentage of cell-free fetal DNA originating almost exclusively from the cytotrophoblast is only about 10 % on average. Another diagnostic approach uses single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the cfDNA. Published evidence confirms a sensitivity of NIPT in excess of 99 % and a false-positive rate of significantly less than 1 % for trisomies 21 and 18 and indicates a superior test performance for trisomy 21. The inclusion of other chromosome anomalies in the future is highly likely. NIPT is currently available worldwide despite ongoing patent litigation involving multiple companies [9].

Independent experts and professional organizations currently consider NIPT not to be diagnostic due to false-positive and false-negative results but rather to be an advanced screening tool [8]. There is also consensus regarding certain requirements which must be met for NIPT [10] [11].

Comprehensive counseling regarding the different prenatal diagnostic options including all benefits and limitations of the individual approaches as legally required by the Law on Genetic Testing in Humans is obligatory. An ultrasound scan prior to testing should be inconspicuous without indication for chromosomal anomalies or other untreatable fetal diseases. A targeted malformation scan should precede NIPT considering the high costs and relatively long duration of the test. Therefore, NIPT should not be scheduled earlier than at 11 + 0 weeks of gestation in order to be able to exclude severe anomalies such as anencephaly as well as markers for trisomy 18 or 13 such as holoprosencephaly, hygroma colli, omphalocele, etc. Since an increased nuchal translucency may also indicate other structural chromosomal disorders, syndromes, and isolated malformations, the benefit of these markers and ultrasound at 11 – 14 weeks of gestation remains uncontested.

Following NIPT a targeted malformation scan should be recommended at 20 to 22 weeks of gestation. It remains to be settled whether the sonographic examinations and consequently NIPT should be restricted to centers or specially trained operators or be integrated into basic screening.

After a negative NIPT, a small residual risk for the trisomies included in the test as well as an unchanged risk for chromosome anomalies not included in the test will remain. General screening of low-risk pregnancies is currently not recommended due to a lack of data for this group as well as for multiples.

Available performance data are primarily based on pregnancies with an increased risk for trisomies 21, 18, and 13 after an abnormal first trimester test or due to an advanced maternal age.

In low-risk pregnancies and for rare trisomies, the probability of a false-positive result may be higher than for a true-positive test result [12]. Morain et al. [1] noted that the prevalence of trisomy 21 in most series is very high (up to 1:8) producing impressively high positive predictive values (PPV) of 97.94 % and negative predictive values (NPV) of 99.99 %. For a prevalence of 1:200, the PPV would drop to 62.59 %. This supports the position to currently not use NIPT as a diagnostic test and to confirm all positive test results by conventional karyotyping prior to termination of pregnancy. This by no means lessens the significant benefit of NIPT as an advanced screening test.

In many comments and reports the term “high risk pregnancies” is used but not defined in detail. In true high-risk cases with abnormal ultrasound findings or a risk of > 1:50 after a first trimester test, a comprehensive chromosome analysis requiring an invasive procedure is still recommended because of the high proportion of unbalanced chromosome counts not covered by NIPT [10]. This is one of the reasons that some experts favor a regulation which restricts NIPT requests to specialized ultrasound centers.

In summary, NIPT is an additional test which does not replace but complements invasive chromosome testing, the first trimester test and sonographic nuchal translucency measurements. In fact, the role of ultrasound for the exclusion of malformations as well as risk assessment prior to clinical and diagnostic decision-making is rather strengthened. Regulations and screening strategies have to be settled. Options currently being evaluated include stepwise screening following the first trimester test or contingent screening. The relevant professional organizations should establish an ongoing evaluation of these concepts. As a prenatal genetic test, NIPT is regulated by the Law on Genetic Testing in Humans and requires signed informed consent. International professional organizations currently recommend a first trimester test prior to NIPT as a basis for decision-making. Depending on the result and ultrasound findings, a choice between noninvasive and invasive testing may be made. Should the uptake of NIPT increase in the future, the number of invasive procedures including their sequelae such as procedure-related abortion and other complications will drop significantly.

The first trimester test for risk assessment should currently be offered to all pregnant women. Doctors providing pre-test counseling should be aware that the benefits and limitations may be difficult to communicate. The introduction of NIPT has made counseling even more complex. From an ethical standpoint, it must be ensured that the requirements for an autonomous decision are met and sufficient time for consideration is provided in order to prevent automatisms in decision-making. Moreover, every pregnant woman should have access to formal genetic counseling. It has to be kept in mind that NIPT may be abused for sex selection. According to the Law on Genetic Testing in Humans, this is explicitly forbidden and all measures must be taken to prevent misuse.

Vor einigen Wochen wurde in der ganzen Schweiz ein Informationsblatt versandt, indem wörtlich eine „Sommeraktion“ angekündigt wurde. Es wurde hierin mitgeteilt, dass der Preis für einen nicht invasiven Chromosomentest (NIPT) deutlich günstiger werde. Der Terminus „Sommeraktion“ war mehr als ungewöhnlich und irritierend, gerade im Zusammenhang mit einem Verfahren, dass seit 1 Jahr als möglicher besserer Test zur Erkennung z. B. des Down-Syndroms und anderen Trisomien die Pränataldiagnostik vor neue Herausforderungen stellt.

Neu und ungewöhnlich in der pränatalen Medizin und im Ultraschall ist ein z. T. recht aggressives Marketing, das u. a. auch von den amerikanischen Fachgremien besonders beklagt wird [1]. Wenn auch die Kostenreduktion uneingeschränkt zu begrüßen ist, ist unter ethischen Gesichtspunkten ein differenzierter Umgang mit diesem sensiblen Thema mehr als wünschenswert. Grundsatzfragen, die sich in diesem Bereich stellen, sind neben den fachlichen Bewertungen ethisch moralische Anforderungen, die möglichst breit diskutiert und im Konsens gelöst werden müssen.

Seit Jahrzenten werden im Rahmen der Schwangerenvorsorge werdenden Eltern Ultraschall-Screeninguntersuchungen insbesondere zur Erkennung von Mehrlingen, von Wachstumsstörungen, maternalen Risiken wie der Präeklampsie, Anomalien der Placentation und Placentalokalisation sowie von fetalen Fehlbildungen angeboten. Die Rate von schweren angeborenen Anomalien liegt bei ca. 3 – 4 %. Etwa 1 % davon betreffen Chromosomenstörungen. In den 70ger-Jahren wurde zunächst die Amniocentese ab 16 Schwangerschaftswoche (SSW) zur Chromosomenuntersuchung etabliert und in den 80ger-Jahren durch die Chorionzottenbiopsie (CVS) ab 11 SSW als frühe Methode zur Chromosomenanalyse ergänzt. Randomisierte Studien wiesen für beide invasive Verfahren ein Fehlgeburtsrisiko von ca. 0,5 – 1 % auf. Lange Jahre galt das mütterliche Alter als Hauptrisiko und alleiniges Zugangskriterium zur fetalen Karyotypisierung. Parallel zur demografischen Entwicklung, die zeigt, dass in den meisten industrialisierten Ländern mehr als 30 % der Schwangeren nunmehr 35 Jahre oder älter sind, wurden bessere Screeningparameter als die sogenannte Altersindikation etabliert.

Die Messung der fetalen Nackentransparenz (NT)) zwischen 11 + 0 SSW 11+ 0 SSW und 13 + 6 SSW zeigt als sonografischer Marker die beste Diskrimination zwischen Schwangerschaften mit einer Trisomie 21 bzw. anderen Aneuploidien und nicht betroffenen Feten. Große prospektive Multizenterstudien bestätigten, dass der sogenannte „combined test“, d. h. die Kombination des mütterlichen Alters und der NT mit den mütterlichen Serummarkern wie dem freien ß-hCG und dem „pregnancy associated plasma protein A“ (PAPP-A) für die Trisomie 21 eine Entdeckungsrate von rund 90 % bei einer FPR von 5 % aufweist [2] [3].

Weitere sonografische Befunde wie Fehlen des Nasenbeins, die Tricuspidalklappeninsuffizienz und ein pathologischer Fluss im Ductus venosus erhöhen die Sensitivität bzw. senken die Falsch-positiv-Rate [2] [4].

Damit ist festzuhalten, dass die alleinige Berücksichtigung des mütterlichen Alters bei der Indikationsstellung zur invasiven Diagnostik nicht mehr dem heutigen diagnostischen Standard genügt. Dies gilt auch für das Serummarker-Screening (sog. Triple Test) im zweiten Trimenon, wenn nicht in Ausnahmefällen die Schwangerschaft erst spät festgestellt wird.

Im vielen Ländern wird daher auch von den Fachgesellschaften ein „combined Test“ gemäß den Empfehlungen der Fetal Medicine Foundation (FMF) UK und der FMF Deutschland angeboten [2] [3] [5]. Auf der Basis eines unterschiedlichen Algorithmus zur individuellen Risikokalkulation integrieren beide standardisierte Anforderungen zur Qualitätssicherung der NT-Messung, die technisch anspruchsvoll ist und besonders von der Erfahrung des Ultraschallers abhängt. Eine Risikokalkulation unter Einbeziehung von NT-Messungen, die nicht die anerkannten Qualitätssicherungskriterien erfüllt, ist damit nicht statthaft und bedarf zusätzlicher Qualifikation und einer jährlichen erneuten Zertifizierung.

Mit der Einführung des sogenannten „combined tests“ konnte in den letzten 10 Jahren die Rate an invasiven Eingriffen um ca. 50 % reduziert werden bei gleichzeitiger Steigerung der Detektionsraten auf ca. 90 %. Dies bestätigen sowohl die eigenen Untersuchungen in einzelnen Zentren als auch die Publikationen in Ländern mit einem etablierten Screeningprogramm, welche den Ersttrimestertest eingeführt haben, wie z. B. Dänemark [6].

Ein Nachteil hierbei ist, dass die Standardisierung der NT-Messung auch 10 Jahre nach breit angelegter Einführung des sog. Ersttrimestertests einen großen Aufwand mit einer zusätzlichen Qualifizierung neben der üblichen Weiterbildung erfordert und in hohem Maße fehleranfällig bzw. sehr untersucherabhängig ist. Ferner zeigt sich, dass eine kontinuierliche Supervision durch die jeweiligen Fachgremien mit jährlichem Audit zur Rezertifizierung unumgänglich erscheint, aber auch einen großen organisatorischen Aufwand erfordert.

Seit Jahrzehnten wurde von einigen Forschungsgruppen die Vision einer nicht invasiven Methode zur Erkennung von Chromosomenstörungen im mütterlichen Blut verfolgt. Jahrelang wurde die Isolierung fetaler Zellen (nukleierte Erythrocyten und Trophoblastzellen) angestrebt, um Aneuploidien durch eine einfache Blutentnahme zu diagnostizieren. In der NIH-Kollaborativ-Studie zeigte sich jedoch, dass diese Methode in der Routinediagnostik nicht Erfolg versprechend war [7]. Ein großer Fortschritt gelang erst vor ungefähr zehn Jahren als nachgewiesen wurde, dass zellfreie fetale DNA-Fragmente im mütterlichen Serum vorhanden sind und neue Verfahren zur Hochdurchsatzsequenzierung eingeführt wurden. Die überwiegende Mehrheit der Studien erfolgte in Risikoschwangerschaften mit einem erhöhten Risiko für Chromosomenstörungen und analysiert die Trisomie 21, 18, 13. Bereits gute Erfahrung mit klinischen Einsatz findet diese Methode ferner zur Feststellung des kindlichen Rhesusfaktors. Zudem kann die NIPT zur Feststellung des kindlichen Geschlechts bei geschlechtsspezifischen Erkrankungsrisiko eingesetzt werden.

Die Analyse selbst basiert auf der Quantifizierung der chromosomenspezifischen DNA im mütterlichen Plasma [8]. Der Anteil zellfreier fetaler DNA beträgt etwa 10 %. Dabei handelt es sich um DNA aus den Zytotrophoblasten. Ein anderer Ansatz beruht auf der Untersuchung von single nucleotide polymorphisms (SNP’s) der cfDNA. Die Sensitivität der NIPT liegt nach bisheriger Studienlage bei über 99 % bei einer Falsch-positiv-Rate von deutlich unter 1 % für die Trisomien 21 und 18, wobei die diagnostische Sicherheit für die Trisomie 21 am höchsten ist. Eine Ausdehnung der Tests auf andere unbalancierte Chromosomenanomalien scheint wahrscheinlich. Weltweit wird die NIPT mittlerweile trotz laufender Patentstreitigkeiten von mehreren Firmen angeboten [9].

Von unabhängige Experten und Fachgesellschaften wird die NIPT z. Zt. aufgrund falsch positiver und falsch negativer Resultate nicht als diagnostische Untersuchung, sondern als ein erweiterter Screeningtest angesehen, auch wenn die Ergebnisse sehr ermutigend sind [8].

Auch herrscht ein Konsens darüber, dass bestimmte Voraussetzungen zur NIPT gegeben sein sollten [10] [11].

Eine ausführliche Beratung über die verschiedenen Optionen in der Pränataldiagnostik, inklusiver aller Vorteile und Grenzen der jeweiligen Methoden, gemäß dem Gesetz zu genetischen Untersuchungen am Menschen ist obligat zu fordern.

Die Ultraschalluntersuchung sollte vorab unauffällig ohne Hinweis für Chromosomenanomalien oder andere nicht behandelbare Erkrankungen des Feten sein. Insbesondere in Anbetracht der hohen Kosten, aber auch aus zeitlichen Gründen sollte eine gezielte Fehlbildungsdiagnostik vorausgehen.

Der Zeitpunkt der Untersuchung kann damit nicht vor 11 + 0 SSW gelegt werden, um z. B. sonografisch erkennbare Anomalien wie eine Anencephalie aber auch eindeutige Hinweiszeichen (Holoprosencephalie, Hygroma colli, Omphalocele etc.) für z. B. eine Trisomie 18 oder 13 auszuschließen. Da eine erhöhte Nackentransparenz auch auf andere strukturelle Chromosomenstörungen, Syndrome und isolierte Fehlbildungen hinweisen kann, ist die Bedeutung diese Markers und des Ultraschalls mit 11 – 14 SSW weiterhin unbestritten.

Nach NIPT sollte zusätzlich ein gezielter Fehlbildungsausschluss mit 20 – 22 SSW als Back-up empfohlen werden. Ungeklärt bleibt, ob diese sonografischen Untersuchungen und damit die NIPT zum frühen Fehlbildungsausschluss nur von Zentren bzw. von speziell qualifizierten Untersuchern durchgeführt werden sollen oder dem Basisscreening überlassen werden können.

Bei unauffälligem NIPT verbleibt ein kleines Restrisko für die untersuchten Trisomien, aber auch für alle anderen nicht untersuchten Chromosomenanomalien.

Ein generelles Screening im Niedrig-Risikokollektiv ist z. Zt. nicht zu empfehlen.

Bei Mehrlingen und im Low-Risikokollektiv liegen noch keine validierten Daten vor.

Die bisherigen publizierten Erfahrungen stammen überwiegend von Schwangerschaften mit erhöhtem Risiko für eine Trisomie 21, 18 und 13 beispielsweise nach einem auffälligen Ersttrimestertest. In Kollektiven mit nicht erhöhtem Trisomierisiko besteht die Gefahr, dass für seltene Trisomien die Wahrscheinlichkeit für ein falsch positives Resultat größer ist, als für ein richtig positives [12]. Morain et al. [1] verweisen darauf, dass in den meisten Studien die Prävalenz der Trisomie 21 mit z. T. bis 1:8 sehr hoch ist und dadurch beeindruckend hohe positive Vorhersagewerte (PPV) von 97,94 % und negative Vorhersagewerte (NPV) von 99,99 % erzielt wurden. Läge die Prävalenz im Bereich von 1:200, würde der PPV auf 62,59 % sinken. Dies unterstützt die Stellungnahmen, die NIPT zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht als diagnostischen Test einzusetzen und positive Testergebnisse nach NIPT mittels konventioneller Karyotypisierung vor einer Schwangerschaftsbeendigung zu bestätigen. Gleichzeitig mindert es aber nicht den großen Nutzen der NIPT als erweiterten Screeningtest.

In vielen Stellungnahmen und Publikationen werden z. Zt. „Hochrisikoschwangerschaften“ zugrunde gelegt, was allerdings bislang nicht näher definiert ist. Bei echten Hochrisikofällen wie auffälligem Ultraschallbefund oder etwa einem Risiko von > 1:50 nach ETT ist auch weiterhin eine zytogenetische Diagnostik nach invasivem Eingriff zu favorisieren, da z. B. in Kollektiven mit einem sehr hohen Risiko nach ETT eine hohe Rate an anderen Chromsomenstörungen gefunden wird [10]. Nachvollziehbar ist daher, dass von einigen Experten gefordert wird, dass die Indikationsstellung zur einer NIPT auf spezialisierte Ultraschallzentren beschränkt wird.

Zusammenfassend ist der NIPT ein zusätzlicher Test, der die bisherige invasive Chromosomendiagnostik und das Screening ebenso wie den Ersttrimestertest und die sonografische Nackentransparenzmessung nicht ersetzt aber ergänzt. Die Be-deutung des Ultraschalls zum Ausschluss von Fehlbildungen und Risikospezifizierung als Entscheidungsgrundlage oder Voraussetzung zur weiteren Chromosomenuntersuchung nimmt eher zu. Diskutiert werden müssen Rahmenbedingungen und neue Screeningstrategien. Alternativen, die z. Zt. evaluiert werden, sind einerseits ein stufenweises Screening nach Ersttrimestertest oder ein „Kontingentes Screening“. Die Fachgesellschaften sind gut beraten, die Konzepte fortlaufend zu bewerten.

Aufgrund seines prädiktiven Charakters unterliegt die NIPT dem Gesetz über genetische Untersuchungen beim Menschen und darf nur dann durchgeführt werden, wenn das Einverständnis der Schwangeren schriftlich vorliegt. Nach gegenwärtigem Stand der Diskussion empfehlen die internationalen Gesellschaften zunächst die Durchführung des Ersttrimestertest als Entscheidungsgrundlage. Je nach Ergebnis und Ultraschallbefund gibt dies der Schwangere die Option eine invasive Diagnostik oder einen nicht invasiven Chromosomentest durchführen zu lassen. Insgesamt ist zu erwarten, dass es zu einer weiteren deutlichen Reduktion von invasiven Eingriffen und damit unnötigen Schwangerschaftskomplikationen, wie eingriffsbedingten Aborten, kommen wird.

Der Ersttrimestertest sollte zum gegenwärtigen Zeitpunkt allen Schwangeren zur Risikospezifizierung angeboten werden. Hierbei ist zu beachten, dass der Nutzen und die Grenzen nicht leicht vermittelbar sind. Mit der Einführung der NIPT ist die Beratung eher noch komplexer geworden. Aus ethischer Sicht ist sicherzustellen, dass die Voraussetzungen für eine autonome Entscheidung der Schwangeren eingehalten werden und ausreichend Bedenkzeit besteht, um Automatismen bei der individuellen Entscheidungsfindung entgegenzuwirken. Jeder Schwangeren sollte darüber hinaus die Option einer formalen genetischen Beratung offenstehen. Unbedingt zu beachten ist auch, dass die NIPT ein großes Risiko der Geschlechtsselektion birgt. Gemäß den gesetzlichen Vorgaben des Genetikgesetzes ist dies nicht zulässig, sodass entsprechende Maßnahmen zur Vermeidung eines Missbrauchs getroffen werden müssen.

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